키메라 항원 수용체와 치료용 항체에 의해 증강되는 NK 세포 독성을 생세포 영상 및 유동 세포분석을 이용해 정량화합니다

본 연구실은 건강 및 질병 상태에서 자연 살해(NK) 세포의 역할을 연구하며, 이를 활용해 고형암 및 혈액암 치료법을 개선하는 것을 목표로 합니다. 기존의 NK 세포 세포독성 분석법은 플랫폼과 설정 간의 표준화가 부족한 실정입니다. 본 프로토콜은 정확한 세포독성 평가를 위해 재현 가능한 살아있는 세포 이미징 및 유세포 분석 방법을 제공합니다.

먼저, 15mL 원추형 바닥 원심분리 튜브에 SYTOX Orange 스톡 용액을 NK-92 배양 배지로 희석하여 2x SYTOX Orange 10밀리리터를 준비합니다. Trypan Blue와 혼합한 후 Luna Counter를 사용하여 표적 세포 수를 측정하거나, 검증된 다른 염료 배제 기반 세포 계수법을 사용하십시오. 필요한 양의 표적 세포를 15mL 원추형 바닥 원심분리 튜브로 옮깁니다.

튜브를 실온에서 300G로 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 그다음 표적 세포를 2X SYTOX Orange 배지에서 최종 농도가 mL당 250,000 cells이 되도록 재현탁합니다. 작동 세포를 준비하기 위해 NK-92 세포의 생존율과 농도를 측정하며, 생존율이 낮으면 분석 성능에 영향을 줄 수 있으므로 생존율이 80% 이상인 경우에만 진행하십시오.

필요한 수의 NK-92 세포를 계수하여 개별 15 milliliter 원추형 바닥 원심분리 튜브로 옮깁니다. 원심분리 후, 세포를 1 mL당 500,000 cells의 최종 농도로 재현탁합니다. 2:1 작용 세포 대 표적 세포 비율을 위해 96-well 라운드 바텀 플레이트의 웰에 작용 세포 240 microliters를 첨가하여 작용 세포 희석액을 준비하고, 나머지 웰에는 배지 120 microliters를 첨가합니다.

이펙터 대 타겟 비율을 2:1, 1:1, 0.25:1로 2배 연속 희석하며, 피펫팅을 최소 5회 이상 하여 충분히 혼합하고 전이 단계마다 팁을 교체하십시오. 다음으로, 공배양을 설정하기 위해 폴리라이신(polylysine) 코팅된 평평한 바닥의 96웰 플레이트를 준비합니다. 전이 직전에 기포가 생기지 않도록 타겟 세포와 이펙터 세포를 충분히 재현탁한 후, 각 세포 현탁액 100 µL를 해당 웰에 첨가하십시오.

그런 다음, 주변의 사용하지 않은 웰에 200 µL의 PBS를 추가합니다. 플레이트를 상온에서 100G로 2분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 라이브 셀 이미징 시스템에 배치합니다.

37°C, 5% 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 1시간 간격으로 이미지를 획득하십시오. 첫 번째 스캔 후 이미지 품질을 확인하고 필요에 따라 이미지 설정을 조정하십시오. SYTOX Orange가 녹색 채널로 유입되는 스필오버(spillover) 현상을 보정하기 위해 스펙트럼 언믹싱(spectral unmixing)을 조정하십시오.

오렌지색 양성 사멸 세포가 녹색 양성 세포로 오인되지 않았는지 확인하십시오. 비부착 세포의 개별 분석을 설정하려면, 예상 객체 직경을 대략적인 세포 직경과 일치하도록 15 micrometers로 설정하십시오. 임계값 민감도(threshold sensitivity)와 텍스처 민감도(texture sensitivity)는 5로 설정하고, 세포 클러스터의 분리를 용이하게 하기 위해 엣지 민감도(edge sensitivity)는 10으로 설정하십시오.

데브리와 커다란 물체를 제외하기 위해, 허용 객체 영역 필터 범위를 50에서 2,000 square micrometers로 설정하십시오. 세포가 아닌 물체를 제외하기 위해 편심률 최대값을 0.95로 설정하십시오. 16에서 24시간 동안 배양한 primary human NK cells를 준비하십시오.

500,000개의 표적 세포를 15 milliliter 원추형 바닥 원심분리관으로 옮깁니다. 10 milliliters의 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 상온에서 300G로 5분 동안 세포를 원심분리합니다.

그런 다음 상층액을 제거합니다. 5 mM CFSE 스톡 솔루션 1 µL를 PBS 10 mL에 희석하여 0.5 µM의 carboxyfluorescein succinimidyl ester(CFSE) 작업 용액을 PBS로 준비합니다. 얻어진 펠렛을 CFSE 용액에 1 mL당 약 100만 개의 세포 농도로 재부유합니다.

빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 감싼 상태에서 세포를 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 그 다음, 배양액을 5~10배 부피로 첨가하여 반응을 정지시키고, 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 세포를 원심분리한 후, 100 µL에 25,000 cells가 포함되도록 세포 펠릿을 250,000 cells/mL 농도로 재부유시킵니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 라운드 바텀 96웰 플레이트의 지정된 웰에 타겟 세포를 웰당 100 µL씩 분주합니다. 각 조건은 3반복으로 플레이팅합니다. 다음으로, 각 테스트 항체 및 일치하는 이소타입 대조군에 대해 NK 세포 배양 배지를 사용하여 4X 항체 용액 200 µL를 준비합니다.

항체 용액을 딥 웰 플레이트로 옮깁니다. 표적 세포가 들어 있는 각 웰에 항체 용액 50 µL를 첨가하고, 피펫팅을 최소 5회 이상 반복하여 충분히 혼합합니다. 항체 미첨가 대조군 웰에는 웰당 50 µL의 NK 세포 배양 배지를 첨가하고 피펫팅으로 충분히 혼합합니다.

표준 배양 조건에서 플레이트를 25분에서 30분 동안 배양합니다. NK 세포를 계수하여 200,000개를 확보하고, 생존율이 75% 이상인 경우에만 진행합니다. primary human NK cell culture 800 µL 내에서 세포 농도가 mL당 250,000개가 되도록 세포를 재부유합니다. 각 웰에 NK 세포 50 µL를 추가하고, 피펫팅을 최소 5회 이상 반복하여 충분히 혼합합니다.

다음으로, 대조군 웰에 배양액 50 µL씩을 피펫으로 분주하고 충분히 혼합합니다. 라운드 바텀 96-웰 플레이트를 주의 깊게 살펴 모든 웰에 200 µL가 들어 있는지, 메니스커스 높이가 균일하며 기포가 없는지 확인합니다. 플레이트를 100G에서 2분 동안 원심분리한 후, 표준 배양 조건에서 16~18시간 동안 배양합니다.

플레이트를 300G에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 모든 웰을 웰당 200 µL의 형광 활성 세포 분류 또는 FACS 버퍼로 세척합니다. 여기에 제시된 대로 FACS 버퍼를 사용하여 표면 항체 마스터 믹스를 준비합니다.

웰당 50 µL의 항체 마스터 믹스(antibody master mix)로 세포를 재부유시키고, 피펫팅을 최소 5회 이상 반복하여 충분히 혼합합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 감싼 뒤, 4 °C에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다. 웰당 150 µL의 FACS 버퍼를 추가합니다.

원심분리 후, 웰당 100 µL의 5 µM DAPI가 포함된 FACS 버퍼에 세포를 다시 현탁합니다. 사전 배양 단계 없이 즉시 유세포 분석 데이터 수집을 진행합니다. Cytek Aurora 기기를 사용하여 유세포 분석을 수행하고 CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI 및 기타 추가 형광체의 형광 채널을 기록합니다.

공동 배양 중에 이펙터 세포, 살아있는 표적 세포 및 죽은 세포를 실시간 살아있는 세포 현미경으로 시각화하였습니다. CAR2 및 CAR3 NK-92 세포는 동일한 이펙터 대 표적 비율에서 특히 초기 시점에 CAR1-NK-92 세포보다 더 빠른 살상 역학을 보였습니다. 천연 세포 독성을 나타낸 대조군 NK-92 세포를 포함하여, 이펙터 대 표적 비율이 높을수록 표적 세포 살상이 증가했습니다.

CAR2 및 CAR3 NK-92 세포는 더 후기 시점에서 더 낮은 작동 세포 대 표적 세포 비율(effector to target ratios)에서 더 높은 효능을 보였습니다. 반면, 더 초기 시점에서는 중간 작동 세포 대 표적 세포 비율에서 강화된 효능이 관찰되었습니다. 작동 세포 집단 전반에 걸친 CAR-NK-92 세포의 효능, 살상 역학 및 전반적인 세포 독성 성능을 정량화하기 위해 KR50, KT50 및 IKI-50의 세 가지 파라미터가 정의되었습니다.

daratumumab 단독 추가는 표적 세포의 생존율을 감소시키지 않았으며, 이는 이펙터 세포가 없을 때 해당 항체가 표적 세포의 생존력에 직접적인 영향을 미치지 않음을 확인시켜 주었습니다. NK 세포와의 단독 공배양은 표적 세포의 생존율을 약 70%로 감소시켰으며, 이는 기초적인 자연 세포 독성을 나타냅니다. daratumumab을 추가했을 때 세포 생존율은 약 37%까지 더 감소하였으며, 이는 항체 매개 세포 독성이 강화되었음을 보여줍니다.

반대로, isotype 대조군 조건은 NK 세포 단독 조건과 유사하게 약 62%의 생존율을 보였습니다. NK 세포 탈과립화는 항체가 없는 NK 세포-표적 세포 공동 배양에서 가장 낮았으며, daratumumab 처리 조건에서 약 31%로 가장 높게 나타난 반면, isotype 대조군은 약 19%의 중간 정도의 탈과립화를 보였습니다. 본 프로토콜을 통해 연구자는 NK 세포의 자연 세포독성을 정량화하고, CAR-NK 디자인의 종양 살해 능력을 평가하며, 단클론 항체의 ADCC 효능을 비교할 수 있습니다. 이 프로토콜을 수행할 때 핵심 고려 사항은 신뢰할 수 있고 해석 가능한 결과를 보장하기 위해 NK 세포 및 표적 세포의 정확하고 일관된 세포 수 측정, 피펫팅 및 플레이팅을 유지하는 것입니다.

향후 연구에서는 이러한 프로토콜을 활용하여 NK 세포의 면역 회피를 탐구하고, 종양 감수성을 비교하며, 다양한 암종에 걸쳐 새로운 NK 세포 기반 면역 요법을 평가할 수 있습니다.