Optogenetic Allosteric Regulation을 통한 단백질 활성의 시공간 제어

우리의 전반적인 연구는 빛에 의한 단백질 활동의 정확한 시공간 제어를 달성하는 광유전학적 방법을 개발하는 데 중점을 둡니다. 당사는 알로스테릭 조절을 위해 lightR이라는 광 조절 가능한 도메인을 엔지니어링하여 시공간 조절 단백질 활성이 세포 신호 및 기능에 미치는 영향을 연구하여 전임상 질병 모델링 및 치료법 개발을 지원합니다. 광유전학은 표적 단백질 활성의 정밀하고 가역적인 제어를 달성하고 내인성 신호 역학을 정확하게 모방하는 등 여러 가지 과제에 직면해 있습니다.

주요 문제는 원치 않는 활성화를 방지하고, 표적 세포 내 활성화를 가능하게 하며, 세포 생존력을 보존하기 위해 광독성을 관리하는 것입니다. 또한 보편적으로 호환되고 견고한 도구를 개발하는 것은 응용 분야의 다양성과 재현성을 개선하는 데 매우 중요합니다. lightR 도구 엔지니어링을 위한 당사의 프로토콜은 알로스테릭 조절, 고감도, 공간 분해능, 엄격한 시간 제어 및 정밀한 신호 특이성을 포함한 여러 고급 기능을 단일 시스템에 고유하게 결합합니다.

이러한 통합은 다양한 표적 단백질에 대한 조정 가능성을 허용하여 이러한 중요한 기능 중 하나 이상이 부족할 수 있는 다른 방법의 격차를 해결합니다. 우리는 세포 이동을 조절하는 주요 신호 전달 및 구조적 과정을 정의하는 데 관심이 있습니다. 우리는 광유전학 기술을 사용하여 내피 세포 이동 및 상호 작용의 규정을 해부하는 것을 목표로 합니다.

세포외 기질의 리모델링이 내피 세포에 의해 어떻게 매개되는지 이해하고 이러한 과정의 조절 장애가 질병 발병에 어떻게 기여하는지 확인하십시오. lightR kinases의 생화학적 분석을 위해 각 실험 그룹에 대해 3.5cm 세포 배양 접시에 대해 6개의 lin XE 세포의 거듭제곱으로 10을 1배 플레이트하고 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 16-18시간 동안 배양합니다. 다음 날, 적절한 transfection 시약을 사용하여 선택한 DNA 구조체를 가진 세포를 transfection합니다.

접시를 알루미늄 호일로 덮고 인큐베이터로 되돌립니다. 16-18시간의 transfection 후 465나노미터 LED 패널 램프 시스템을 조직 배양 인큐베이터 내부에 배치합니다. 구멍이 뚫린 플렉시 유리 패널을 램프에서 10cm 위에 배치하여 평방 센티미터당 3밀리와트의 조명을 얻습니다.

LightR-Src 및 D388 R-LightR-Src를 발현하는 세포에서 연속 조명을 사용합니다. LED 패널을 수동으로 켜고 꺼서 조명을 제어합니다. 실험 시점이 끝나면 안전한 적색광 아래에서 세포를 수확하고 매체를 흡인하고 차가운 PBS로 세포를 세척합니다.

엔지니어링된 LightR-Src를 사용한 lin XE 세포의 글로벌 조명은 촉매 비활성 D388 RLightR-Src 돌연변이를 발현하는 Src 기질, 내인성 팍실린 및 p130Cas 세포의 인산화를 보여주며, 글로벌 조명에서 Src 기판의 인산화를 보여주지 않습니다. 시작하려면 세포 배양 배지에서 35mm 조직 배양 접시당 5개의 헬라 세포의 거듭제곱으로 2 곱하기 10을 플레이트합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 2시간 동안 세포를 배양합니다.

세포가 부착되어 60-70% 밀도에 도달하면 주어진 혼합물로 hella 세포를 cotransfection합니다. 셀의 우발적인 조명을 방지하기 위해 접시를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 그런 다음 섭씨 37도에서 16-18 시간 동안 세포를 배양하고 5 % 이산화탄소를 배양합니다.

다음으로, 직경이 25mm이고 두께가 0.17mm인 덮개가 있는 유리를 6웰 플레이트 챔버에 넣습니다. PBS에서 3 개의 둥근 유리 커버 슬립에 피브로넥틴 리터 당 5 밀리그램을 코팅하고 밤새 섭씨 37도에서 배양합니다. 그런 다음 형질주입 후 16-18시간 후에 PBS로 커버 슬립을 헹굽니다.

transfection된 hela cell을 안전한 적색광에 모은 다음, 안전한 적색광 아래에서 각 커버 슬립에 transfection된 hela cell 5개의 전력으로 약 10회 재생합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 2시간 동안 세포 배양 배지에서 배양합니다. 다음으로 준비한 이미징 매체와 미네랄 오일을 섭씨 37도까지 데웁니다.

그런 다음 세포가 들어있는 덮개 슬립을 PBS로 두 번 씻습니다. 세포를 염색하고 세척한 후 커버 슬립을 살아있는 세포 이미징 챔버에 조심스럽게 넣습니다. 챔버에 1ml의 L15 이미징 매체를 추가합니다.

이미징 중 증발을 방지하기 위해 미리 데워진 미네랄 오일 1mL를 미디어에 추가합니다. 이미징할 준비가 될 때까지 챔버를 섭씨 37도에서 빛으로부터 보호하십시오. 챔버를 섭씨 37도로 예열된 현미경 스테이지에 놓습니다.

빠른 LightR-Src cherry와 Src, IRFP를 모두 발현하는 단일 세포를 선택합니다. 셀 내에서 조명을 비출 특정 관심 영역을 선택합니다. 이 연구에서는 선택한 셀의 주변부에 있는 작은 영역을 선택합니다.

조명 전에 기저 상태에서 20분 동안 매분 선택한 세포를 이미지화합니다. 국소 조명을 비추면서 50분 동안 이미징을 계속한 다음 활성화 후 20분 동안 총 90분 동안 이미징합니다. 이미징 후 분석을 위해 동영상을 tif 스택 파일 형식으로 저장합니다.

헬라 세포의 글로벌 조명은 빠른 LightR-Src의 국소화 유착으로 이어졌으며, 청색광이 꺼지면 반전되었습니다. 이 조명은 또한 세포 확산을 크게 증가시켰으며, 청색광이 꺼지면 중단되었습니다. 촉매 비활성 D388 R-LightR-Src 돌연변이는 세포 확산을 보이지 않았습니다.

빠른 LightR-Src를 발현하는 헬라 세포의 국부적 조명은 국소 접착에 구조체의 축적을 초래하여 50분 조명으로 국부적인 막 돌출부를 생성했습니다. 조명 후 20분 동안 어두워질 때 추가 면적 증가가 관찰되지 않았습니다. Fast LightR-Src는 암흑 단계에서 초점 유착에서 점차 사라졌습니다.

세포 중심이 조명 영역 쪽으로 이동했습니다. 빠른 LightR-Src 활성화 후 지시된 세포 이동을 나타냅니다.