프로그래밍 풀러와 패치 - pipettes와 샤프 전극을 만들기

유리 모세관 피펫은 단일 세포 전기천공법, DNA 미세주입 및 패치 클램프 전기생리학과 같은 매우 다양한 기술을 위해 실험실에서 보편적으로 사용되고 있습니다. 기록을 위한 유리 모세관 패치 클램프 전극을 준비하기 위해, 프로그래밍 가능한 풀러(puller)에서 규산염 유리를 가늘게 뽑아냅니다. 전극 팁을 왁스로 코팅한 다음, 팁을 화염 연마하여 추후 사용을 위해 보관합니다. 안녕하세요, 저는 스탠퍼드 대학교 분자 및 세포 생리학과의 Miriam Goodman입니다.

이 영상에서는 전기생리학을 위한 패치 클램프 피펫과 날카로운 전극(sharp electrodes)을 제작하는 방법을 시연하겠습니다. 피펫이라고도 불리는 유리 미세 전극은 수십 년 동안 전기생리학의 핵심 도구로 사용되어 왔습니다. 오늘날 이러한 피펫은 프로그래밍 가능한 풀러(puller)를 사용하여 유리 모세관으로 제작합니다.

이제 시작하겠습니다. 패치 클램프 피펫을 제작하기 위해 깨끗하고 먼지가 없는 Sutter 보로실리케이트 모세관과 Sutter P-97 화염 연마 마이크로 전극 풀러를 사용합니다. 적절한 풀링 프로그램을 개발하는 데에는 Sutter의 피펫 쿡북(Pipette Cookbook)이 훌륭한 참고 자료가 됩니다.

시작하려면 풀러의 먼지 덮개를 들어 올리십시오. 그런 다음 상자에서 유리 모세관 튜브를 하나 꺼냅니다. 먼지가 쌓이는 것을 최소화하기 위해 뚜껑을 반드시 다시 닫아주십시오.

다음으로, 한 손으로 모세관을 필라멘트 한쪽의 홈으로 밀어 넣고 클램프를 약간 조입니다. 이때 클램프는 튜브가 떨어지지 않을 정도로 충분히 조여져 있어야 하지만, 홈 안으로 밀어 넣을 수 있을 만큼은 느슨해야 합니다. 이제 동일한 쪽에 있는 스프링 금속 스토퍼를 풉니다.

그런 다음 엄지와 검지로 두 캐리어 하단에 부착된 금속 탭을 잡습니다. 반대편의 스프링 금속 스톱을 풉니다. 캐리어들을 최대한 가까이 당겨 한 손으로 고정합니다.

다음으로, 튜브를 필라멘트 하우징을 통해 반대편 캐리어의 홈으로 밀어 넣습니다. 유리가 가열 필라멘트로 밀려 들어가지 않도록 주의하십시오. 양쪽의 클램프를 조입니다.

캐리어를 고정할 수 있을 만큼 충분히 조여야 하지만, 유리가 깨질 정도로 너무 세게 조여서는 안 됩니다. 이제 먼지 덮개를 닫고 녹색 버튼을 누르십시오. 패치 클램프 기록용의 표시된 폴 피펫은 각 단계마다 열과 속도가 감소하고 마지막 단계에서 작은 폴을 형성하는 5단계 폴링 프로그램을 사용하여 제작됩니다.

이 프로그램은 열과 중력을 이용합니다. 날카로운 전극을 제작하는 절차는 매우 유사하지만, 이 경우에는 외경 1 mm, 내경 0.78 mm의 Warner Instruments 사의 얇은 유리 모세관을 사용합니다. 또한 풀링 프로그램이 완료되면 열과 중력 외에 모터를 사용하는 풀링 프로그램을 적용합니다.

먼지 덮개를 들어 올리고 양쪽 클램프를 푼 다음, 완성된 피펫을 꺼냅니다. 그 후 피펫을 작업 상자에 넣습니다. 이 상자는 플라스틱 피펫 팁 상자의 랙에 폼 스트립을 접착제로 붙인 뒤, 폼에 6~8개의 슬롯을 절개하여 만들 수 있습니다.

피펫을 슬롯에 삽입합니다. 박스에 피펫이 모두 채워지면, 화염 연마 단계로 넘어가 피펫을 화염 연마합니다. 화염 연마를 시작하기 전에 풋 페달로 제어되는 백금 가열 필라멘트가 장착된 마이크로 포지 장치를 설치하십시오.

먼저 커패시턴스를 낮추고 노이즈 특성을 개선하기 위해 피펫을 치과용 왁스로 코팅합니다. 이를 위해 녹인 왁스를 소량 준비하여 가까이 둡니다. 왁스가 팁 내부로 들어가지 않도록 피펫 뒷면에 공기압을 가합니다.

그 다음 팁 끝을 액체 왁스에 짧게 담갔다가 꺼냅니다. 피펫을 연마 장치에 거치하고 팁 끝을 필라멘트로부터 약 50 microns 거리까지 접근시킵니다.

가열 시 필라멘트가 팽창한다는 점에 유의하십시오. 짧게 1~2초간 열 펄스를 가하여 피펫 팁 끝의 왁스를 제거하고 유리를 매끄럽게 다듬습니다. 현미경으로 피펫 팁을 관찰하여 개구부의 직경과 매끄러운 정도를 확인하십시오.

표준 패치 클램프 기록을 위해 팁 개구부의 직경은 1~3 µm여야 하며, 거칠거나 고르지 않거나 불규칙한 팁은 폐기하십시오. 완성된 피펫을 작업 상자에 넣고, 먼지로부터 피펫을 보호하기 위해 덮개를 반드시 닫으십시오. 이 과정을 반복하여 성공적으로 10개의 피펫을 제작합니다. 지금까지 프로그래밍 가능 풀러를 사용하여 패치 클램프 피펫과 샤프 전극을 만드는 방법을 살펴보았습니다.

동일한 절차를 사용하여 최적의 패치 클램프 결과를 위한 주입 바늘을 포함한 다양한 유리 도구를 제작할 수 있습니다. 실험 당일에 먼지가 없는 새 피펫을 뽑고, 실험 시작 1시간 이내에 이를 연마하는 것이 중요합니다. 또한, 검사를 통해 피펫이 매끄럽게 연마되었는지 확인하십시오.

opus oocytes에서 발현된 이온 채널의 패치 클램프 기록 방법을 시연하는 다른 영상도 꼭 시청하시기 바랍니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 이제 여러분은 피펫 전문가가 되셨습니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.