Elektrofysiologische methoden voor opname Synaptic Potentials van de NMJ van Drosophila Larven
6 februari 2009
Hier beschrijven we elektrofysiologische methoden voor het meten van synaptische transmissie bij de neuromusculaire junctie van Drosophila larve. Evoked release wordt kunstmatig geïnitieerd door het stimuleren van de motorische neuron axonen, en de transmissie door middel van de NMJ kan worden gemeten door de postsynaptische respons opgeroepen in de spier.
Om stabiele elektrofysiologische registraties te verkrijgen van neuromusculaire juncties in Joof-larven. Disseceer eerst een larve open om de lichaamswand, spieren en het zenuwstelsel bloot te leggen voorafgaand aan de registratie. De axonen aan de basis van het CZS worden posterior van het ventrale ganglion doorgesneden.
Vervolgens wordt een registratie-elektrode op de betreffende spier geplaatst en een stimulerende elektrode nabij de innerverende motorneuronen. De doorgesneden axonen van de motorneuronen worden in de stimulerende pipet gezogen. Excitatoire junctiepotentialen kunnen vervolgens worden geregistreerd.
Hallo, ik ben Wendy MLA van het McCabe Lab van de afdeling Fysiologie en Cellulaire biofysica aan de Columbia University. Vandaag laten we u een procedure zien voor het meten van de synaptische transmissie bij de neuromusculaire overgang van GE-larven. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de synaptische fysiologie en neurotransmissie te bestuderen.
Laten we beginnen. Om het experiment te starten, worden dwalende derde-stadium- en sterlarven gedisseceerd om de lichaamswand bloot te leggen. Dit protocol is aangepast voor elektrofysiologische experimenten door het gebruik van korte dissectienaaldjes.
Deze zijn ongeveer twee tot vier millimeter lang en hebben een kleinere kans om tijdens het experiment het microscoopobjectief of de elektroden te raken. Nadat de lichaamswand is blootgelegd, wordt een pincet gebruikt om het CZS vast te houden en iets op te tillen. Snijd vervolgens de motorische axonen van de perifere zenuwen door en verwijder het brein.
Nadat de hersenen zijn verwijderd, wordt het gedisseceerde preparaat tweemaal gewassen met HL 3.1-buffer met 1 mM calcium. Nu de dissectie is voltooid, kunnen intracellulaire metingen worden verricht bij de larvale spiercellen. Plaats de dissectieschaal op de elektrofysiologie-microscoop en onderdompel het preparaat in HL 3.1-buffer met calcium.
Bevestig vervolgens de bad-elektrode zodanig dat deze in contact staat met de oplossing. De zuigelektrode wordt gebruikt om de perifere zenuwen te stimuleren die de spier innerveren. Plaats eerst de zuigelektrode in de schaal om trillingen te voorkomen wanneer de intracellulaire elektrode op de spier wordt geplaatst.
Zodra de elektrode in de schaal is, positioneert u deze dicht bij het motorneuron dat spier zes innerveert. Pas in het derde abdominale segment voorzichtig zuigkracht toe totdat de doorgesneden zenuw zich in de glazen pipet bevindt. Wees voorzichtig om de zenuwen niet uit te rekken wanneer de zuigkracht wordt toegepast.
Til de pipet iets op zodat deze de spier niet raakt. Positioneer deze vervolgens zodanig dat er niet aan de doorgesneden zenuwvezels wordt getrokken. Zodra de zuigelektrode op zijn plaats is, positioneert u de registratie-elektrode voor de intracellulaire registraties.
Gebruik een scherpe micro-elektrode gevuld met drie molar kaliumchloride. Positioneer de registratie-elektrode boven het centrum van spier zes. Stel de input-offset zo in dat deze nul aangeeft voor de badoplossing.
Laat de elektrode langzaam zakken en benader de spier onder hoge optische vergroting totdat deze het spieroppervlak raakt. Observeer de oscilloscoop om te bevestigen dat de spier is gepenetreerd. Het rustmembraanpotentiaal moet ten minste -60 millivolt zijn.
Sporadische miniature nplate-potentialen zouden nu zichtbaar moeten zijn. Zodra de registratie-elektrode op zijn plaats zit, laat u de cellen één minuut stabiliseren. Gebruik vóór het starten van de registraties een axon HS two, een head stage in een axle clamp two B-versterker om veranderingen in het membraanpotentiaal te detecteren.
De axle clamp twee B is gekoppeld aan een computer die P clamp-software uitvoert via de digit data 1322 A, die het signaal digitaliseert. Registreer de membraanpotentiaal op een pc. Pas met de clamp X-software stimuli toe op het motorisch axon om excitatoire membraanpotentialen of epsp's op te wekken.
Zodra de ejp's zijn gegenereerd, worden de miniatuur ejp's gedurende een periode van drie minuten opgenomen zonder stimuli-synapsis. Soft mini analyse-software kan worden gebruikt om de traces te analyseren en de amplitude en frequentie van de mini EJP te bepalen. Om ejp's te genereren.
Gebruik een master eight pulsgenerator om het doorsneden uiteinde van een motorisch neuron te stimuleren. De generator moet vierkante spanningspulsen van 0,3 milliseconde afgeven. Hanteer een interval van vijf seconden tussen de stimuli om synaptisch herstel mogelijk te maken.
Registreer bij de NMJ ten minste 10 opgewekte potentialen van elke spier en bereken het gemiddelde van de amplitudes. Deze figuur toont een typische registratie van spier zes van een wild-type sal-larve met opgewekte EJP-responsen en spontane mini EJPs. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe cy-potentialen kunnen worden geregistreerd van de neuromusculaire junctie van drosophila-larven. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de dissectie binnen drie tot 10 minuten moet worden voltooid en dat de elektrofysiologische registraties onmiddellijk moeten beginnen terwijl de cellen nog gezond en responsief zijn.
Als de dissectie te lang duurt, zal het rustmembraanpotentiaal van de spiercellen lager zijn dan -60 millivolt, wat te laag is om te registreren. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft elektrofysiologische methoden voor het meten van de synaptische transmissie bij de neuromusculaire overgang (NMJ) van Drosophila-larven. Het proces omvat het dissekeren van de larven om de lichaamswand en het zenuwstelsel bloot te leggen, gevolgd door het plaatsen van registratie- en stimulatie-elektroden om exciterende junctiepotentialen te meten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Elektrofysiologie
- Neurowetenschap
- Synaptische transmissie
Achtergrond
- Het begrijpen van synaptische transmissie is essentieel voor inzichten in neurale communicatie.
- Drosophila-larven dienen als modelorganisme voor het bestuderen van de NMJ.
- Elektrofysiologische technieken maken een nauwkeurige meting van de synaptische activiteit mogelijk.
- Opgewekte afgifte bij de NMJ kan kunstmatig worden gestimuleerd voor analyse.
Doel van de studie
- Om methoden aan te tonen voor het registreren van synaptische transmissie bij de NMJ.
- Om een protocol te bieden voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in elektrofysiologische studies.
- Om het begrip van neuromusculaire signaleringsmechanismen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Dissectie van Drosophila-larven om de spieren en het zenuwstelsel bloot te leggen.
- Plaatsing van registratie-elektroden op de betreffende spier.
- Gebruik van stimulerende elektroden nabij de motorneuronen.
- Registratie van excitatoire junctiepotentialen na stimulatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van de synaptische transmissie bij de NMJ.
- Demonstratie van opgewekte excitatoire junctiepotentialen.
- Validatie van de elektrofysiologische benadering voor het bestuderen van de NMJ.
- Inzichten in de dynamiek van synaptische signalering in Drosophila.
Conclusies
- De beschreven methoden bieden een betrouwbare aanpak voor het bestuderen van de NMJ-transmissie.
- Elektrofysiologische opnames kunnen belangrijke aspecten van de synaptische functie onthullen.
- Deze studie draagt bij aan het bredere begrip van neuromusculaire interacties.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
Elektrofysiologische registratie bij de neuromusculaire junctie (NMJ) van Drosophila-larven biedt een genetisch hanteerbaar, kwantitatief platform voor het onderzoeken van synaptische functie en neurotransmissie. Dit model maakt targetvalidatie met hoge betrouwbaarheid en mechanische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase mogelijk, wat bijdraagt aan de predictieve beoordeling van synaptische modulatie en genetische perturbaties. De aanpak is direct relevant voor portfolioteams die op zoek zijn naar robuuste, reproduceerbare systemen voor neurobiologie-gestuurde geneesmiddelenontwikkeling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe meting van synaptische transmissie en kwantuminhoud mogelijk voor functionele doelvalidatie.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door genetische of farmacologische effecten op neurotransmissie te isoleren.
- Faciliteert hypothese-gestuurd onderzoek naar synaptische pathways in een gedefinieerd, manipuleerbaar systeem.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerde, reproduceerbare assay voor het kwantificeren van excitatoire junctiepotentialen (EJPs) en miniature EJPs (mEJPs).
- Levert kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor comparatieve analyse tussen verschillende genetische achtergronden of behandelingen met verbindingen.
- Maakt de preparatie van gevalideerde biologische systemen mogelijk voor downstream screeningworkflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelateerde synaptische mechanismen voor translationele continuïteit in neurobiologische programma's.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang door voorspellende gegevens over synaptische functie en modulatie te leveren.
- Biedt een brug van genetische ontdekking naar preklinische validatie bij neuromusculaire en synaptische aandoeningen.
Integratie van pipeline en workflow
Deze elektrofysiologische methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot assayontwikkeling en preklinisch onderzoek, waardoor iteratieve hypothesetoetsing en mechanistische evaluatie mogelijk worden.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het testen van nulhypothesen en de verduidelijking van signaalpaden door synaptische responsen op gedefinieerde manipulaties te kwantificeren.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve read-outs van de EJP-amplitude en -frequentie voor een robuuste assayontwikkeling.
- Analytiek: Biedt gedigitaliseerde, statistisch analyseerbare gegevens voor vergelijkingen tussen verschillende condities en genotypen.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert afstemming met ziekterelateerde synaptische eindpunten voor preklinische continuïteit.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar, genetisch flexibel platform voor voortdurende studies naar neurobiologie en synaptische functies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van synaptische targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert elektrofysiologische workflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over verschillende teams.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënte portfolio-triage mogelijk op basis van kwantitatieve synaptische gegevens.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en het verder ontwikkelen van activa gericht op neurobiologie.
Overwegingen bij implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie en Drosophila-genetica voor een optimale uitvoering.
- Vereist gespecialiseerde instrumentatie, waaronder micro-elektroden, versterkers en digitaliseringshardware.
- Necessiteert standaardisatie van dissectie- en registratieprotocollen over teams heen voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan verschillende genetische achtergronden en experimentele manipulaties binnen het Drosophila-systeem.
- Beperkt tot de context van modelorganismen; translationele extrapolatie vereist zorgvuldige validatie.
