Channelrhodopsin2 Mediated Stimulatie van synaptische Potentials op Drosophila Neuromusculaire verbindingen

Deze procedure begint met het kweken van drosophila. Derde-instar larven met het juiste genotype worden gekweekt op voedsel dat all-trans retinol bevat. Elke larve wordt met spelden bij de kop en de staart vastgezet.

Vervolgens wordt de FLA platgelegd. De hersenen en posterieure zenuwen worden daarna doorgesneden om ritmische motorische activiteit te stoppen. Daarna wordt de blauwe LED-lichtbron met controlebox ingesteld en gefocust op het preparaat.

Gebruik ten slotte een scherpe elektrode om spier zes te doorboren. Dien vervolgens lichtpulsen toe met een spanningsbron. Hallo, ik ben Nicholas Marstein van het laboratorium van Dr. Leslie Griffith, van de afdeling Biologie aan de Brandeis University.

Hoi, ik ben Stefan Pulver, ook van het Griffith Lab. Vandaag laten we u de procedure zien voor het opwekken van synaptische potentialen met channel root absent two bij de neuromusculaire junctie van drosophila-larven. We gebruiken deze procedure in ons lab om de synaptische fysiologie in drosophila te bestuderen.

We gebruiken het ook om studenten synaptische fysiologie en onderwijslaboratoria te doceren. Laten we beginnen. Om met dit protocol te starten, houdt u UAS channel redsin two en okay, 3 7, 1 gal four vliegenlijnen in afzonderlijke flesjes met standaardvliegmedium.

Verzamel maagden uit de, oké, 3 7, 1 gal, vier vliegenlijnen en mannetjes uit de UAS channel redsin. Twee lijnen. Maak vervolgens vliegenmedium dat is gemengd met 1 millimolair all-trans-retinol of ATret. Smelt hiervoor regulier vliegenmedium ongeveer één minuut in een magnetron.

Laat het medium, zodra het gesmolten is, ongeveer 30 tot 60 seconden afkoelen en voeg vervolgens 100 µL van 100 mM a TR in 100% ethanol toe voor elke 10 mL vliegenmedium. Wanneer de vials met TR-medium klaar zijn, plaatst u de verzamelde mannetjes en vrouwtjes in elke vial. Plaats de vials in een donkere ruimte bij 22 tot 25 °C zodat de vliegen kunnen paren en eitjes kunnen leggen; wacht vier tot vijf dagen tot de derde instar-larven zichtbaar zijn.

Op dit punt kunnen de volwassen vliegen worden afgevoerd. We zijn nu klaar om verder te gaan met de opstelling van de elektrofysiologische rig. Bevestig elk oculair van de dissectiemicroscoop aan een blauwe LED-lichtbron met een koellichaam.

Gebruik een standaard en klem om een magnetische basis aan het oculair en de LED-lichtbron te bevestigen. Plaats de magnetische basis op de luchttafel van de elektrofysiologische opstelling. Sluit vervolgens de lichtbron aan op een regelcircuit en verbind dit regelcircuit vervolgens met een externe spanningsbron.

We gebruiken de spanningsuitgang van het PowerLab-elektrofysiologische gegevensacquisitiesysteem van AD Instruments. Zodra dit is aangesloten op de spanningsbron, worden pulsen van één tot vijf volt aan het besturingscircuit gegeven om het blauwe licht te activeren. Pas de magnetische voet en de lichtbron aan totdat de blauwe lichtbundel is gefocust op het gebied waar de dissectie van de larve zal plaatsvinden. Nadat de juiste aanpassingen zijn gemaakt, kunnen we overgaan naar de dissectie van de larve.

Om te beginnen met de dissectie, plaatst u zes spelden van 0,1 millimeter in de bodem van een schaal bekleed met agar. Verwijder een derde-instadium larve uit het voedingsmedium en plaats deze in een plastic Petri-schaal. Spoel de larven met zoutoplossing om eventueel aan de larven klevend voedsel te verwijderen.

Plaats vervolgens de larven in de dissectieschaal nabij de gebogen spelden en vul de schaal voor de helft met zoutoplossing. Orienteer de larven nu zodanig dat u twee zilverachtige buisjes kunt zien die over het dorsale oppervlak van het dier lopen. Deze zilverachtige buisjes zijn de trachea.

Steek een grote speld direct in de staart tussen de tracheaalbuizen. Houd de larven vast en plaats een tweede grote speld in de kop. Zorg ervoor dat het lichaam in de lengte wordt uitgerekt terwijl de speld wordt ingevoerd.

Gebruik een schaar om een kleine incisie nabij de staart te maken. Zet de incisie voort over de gehele lengte van het lichaam. Zorg ervoor dat de schaarpunten omhoog gericht zijn om te voorkomen dat de ventrale zenuwen en/of de spieren van de lichaamswand worden doorgesneden.

Plaats vier pinnen in de vier hoeken van de dieren. Open nu het middendeel. Zet de pinnen in de dissectieschaal zodat het dier wordt uitgespreid.

Zet het preparaat vervolgens vast zodat het met een pincet en schaar kan worden behandeld. Verwijder de spijsverteringsorganen, de trachea en de vetlichamen van het dier. Spoel het preparaat met zoutoplossing.

Lokaliseer na het spoelen de frontale kwabben en het ventrale ganglion van het preparaat met behulp van microscharen. Snijd voorzichtig door het ventrale ganglion net achter de frontale kwabben. Zodra de dissectie is voltooid, kan worden overgegaan tot de stimulatie met blauw licht en de spierregistratie.

Om de spierregistratie uit te voeren, wordt een elektrode met een weerstand van 10 tot 20 mega ohm getrokken. Vul de getrokken elektrode met drie molair KCL met behulp van een elektronische elektrodetrekker. Plaats de gevulde elektrode in de elektrodehouder.

Plaats nu de larvenpreparaat op de opstelling onder een dissectiemicroscoop. Stel het blauwe licht zo in dat het gedissecteerde preparaat in het midden van de lichtbundel staat. Identificeer spier zes of M zes in een willekeurig segment van de lichaamswand van de larve; breng met een micromanipulator voorzichtig de elektrode in M zes aan en let op een snelle hyperpolarisatie van de spier.

Rustmembraanpotentialen moeten liggen tussen de -30 millivolt en -70 millivolt. Zodra de elektrode correct is ingebracht, worden er spanningspulsen van 20 tot 100 milliseconden aan het regelcircuit gegeven. Verhoog de aan de regelkring geleverde spanning stapsgewijs.

Let op het optreden van excitatieve junctiepotentialen in de spiercel. Hier is een representatief resultaat dat een excitatieve junctiepotentiaal laat zien die is opgewekt door korte lichtpulsen. De hier getoonde amplitude van de excitatieve junctiepotentiaal is de gesommeerde amplitude van twee motorneuronen waarvan bekend is dat beide activeren.

M zes. Lagere intensiteiten of kortere lichtduuraties kunnen het excitatoire junctiepotentiaal met een kleinere amplitude van een enkel motorisch neuron blootleggen. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u kanaalrhodopsine-2-gemedieerde stimulatie van synaptische potentialen bij de oph-neuromusculaire junctie uitvoert.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de lichaamswand van het preparaat tijdens de dissectie niet te beschadigen. Onthoud ook dat een preparaat direct na een dissectie overgeëxciteerd kan zijn, maar dat het na verloop van tijd zal kalmeren, wat goede opnames mogelijk maakt. Wees bij het impaleren van spieren voorzichtig om niet voorbij de eerste spierlaag door in de lichaamswand te gaan.

Wanneer uw elektrode in de lichaamswand vastzit, kunt u soms hypergepolariseerde potentialen verkrijgen zonder dat u zich daadwerkelijk in een spiercel bevindt. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.