Visualiseren van antigeen specifieke CD4 + T-cellen met behulp van MHC klasse II tetrameren

Wat de Teer-assay echt uniek maakt, is dat hiermee antigeenspecifieke T-cellen direct gevisualiseerd kunnen worden. De Teer is het belangrijkste unieke aspect van onze assay. Dit is gekoppeld aan een amplificatiestap die wij uitvoeren.

We isoleren de T-cellen en kweken deze vervolgens in een omgeving die het monster verrijkt met de T-cellen waarin we geïnteresseerd zijn. Hierdoor zijn we in staat om specifiek alleen die cellen te labelen en ze te visualiseren met een flowcytometer. Bij eerdere assays, zoals CFSE of proliferatie-assays die al decennia worden gebruikt, verkrijg je slechts een globale bulkmeting van wat er gebeurt met de gehele T-celpopulatie.

Maar er zijn miljoenen T-cellen in het lichaam en zij zien een hele diverse set patronen. Met een beetje geluk is misschien één op de 200.000 tot 300.000 cellen in het monster degene waarnaar u op zoek bent. En dat is waarom deze assay deze verrijkingsstappen bevat.

En vervolgens, met een testnummer, en omdat u direct kleurt, kunt u daadwerkelijk een populatie visualiseren die minder dan 1% van het totaal aantal cellen beslaat, gescheiden van de achtergrond. Hierdoor kunt u zeer kleine verschillen waarnemen en een vrij nauwkeurige telling krijgen van het aantal T-cellen in dat bloedmonster, oftewel in dat individu, die uw specifieke patroon herkennen. Maar het houdt daar niet bij op, want de tetrameren stellen u in staat om deze T-cellen niet alleen te labelen, maar ze ook te isoleren voor verdere analyse.

En de teters die u gebruikt zijn daadwerkelijk hier bij BRI gemaakt, klopt dat? Ja. We zijn een van de weinige laboratoria in het land die met succes klasse 2 teters hebben gemaakt. Onze bedoeling is om deze reagentia tegen kostprijs te distribueren aan alle laboratoria die geïnteresseerd zijn in het importeren van deze technologie.

Wat zijn volgens u de meest moeilijke of uitdagende aspecten van deze assay bij het repliceren ervan in andere laboratoria? Nu ik erover nadenk, zijn er er eigenlijk twee: de groei van de T-cellen. Dat is echt iets wat een beetje een kunst is.

U neemt bijna dagelijks beslissingen over het feit of de cellen extra voedingsstoffen of extra groeiruimte nodig hebben. En dan is er het tweede deel, waarvan ik denk dat het waarschijnlijk het moeilijkst is voor een onervaren operator: de data-analyse. Het uitzoeken welk deel van het signaal daadwerkelijk een positieve respons is, tegenover welk deel simpelweg inherent is aan, weet u wel, de fysica en aantrekkingskracht.

En het feit dat alles in zekere mate aan kleefvermogen heeft, is iets waarvoor opnieuw veel ervaring nodig is, vooral in een context waarin de totale respons wat zwakker zal zijn. Hoe kan de informatie die u met deze assay genereert op dit moment potentieel ten goede komen aan patiënten? Een van de eerste kenmerken die optreden bij elke auto-immuunpatiënt is een soort constellatie van antilichamen die specifiek zijn voor die ziekte.

Uit de basisprincipes van de immunologie weten we dat er altijd eerst een T-celrespons plaatsvindt voordat er een antilichaamrespons optreedt. Als we daarom bij risicogroepen die toename in T-celactiviteit kunnen waarnemen die voorafgaat aan de vorming van antilichamen, zou dat ons helpen om een nieuw risiconiveau te definiëren voor personen die op weg zijn autoantilichamen te ontwikkelen, wat hopelijk een venster opent voor interventieve therapieën. Deze procedure zal antigeenspecifieke CD4-positieve T-cellen zuiveren en expanderen en deze visualiseren met behulp van teters reagentia en apparatuur in klasse 2 laminaire flow biosafety cabinets.

Dit wordt de primaire werkruimte voor de procedure. 50 milliliter conische buizen als primaire buis voor PBMC-isolatie, één XPBS. Deze moet calcium- en magnesiumvrij zijn, foliepak plus folie om tegen licht te beschermen, pipetteerhulp, CoStar 10 mil pipet-aerosolcanisters met 50 mil inserts om bloedcontaminatie van de centrifuge te voorkomen.

GS six R centrifuge overbrengpipetten, Pasteur-pipetten, hemolytische buffer bestaande uit 8,3 g/L ammoniumchloride, 1,0 g/L natriumbicarbonaat, 0,04 g/L DI natrium-EDTA, trypan blauw 0,2% oplossing in PBS, hemo-CYTOMETER, 15 ml conische buis, running buffer bestaande uit PBS aangevuld met 2 mM EDTA plus 5 g/L.

BSA max CD four isolatiekit twee gekocht bij Milin biotech EP magneetblok gekocht bij stem cell technologies. Andere platforms voor magnetische celverrijking kunnen met gelijke effectiviteit worden gebruikt. Vijf milliliter polypropyleenbuis RPMI 1640 aangevuld met 25 millimolair hippies gebruikt voor het maken van T-celmedium gepoold menselijk serum gebruikt als supplement voor T-celmedium pen strip gebruikt als supplement voor T-celmedium 500 milliliter 0,22 micron flesdopfilter steriele 48-wells plaat gebruikt voor in vitro expansiecultuur, stap 37 degree CO2 incubator, 20 milligram per milliliter oplossing van synthetisch peptide bevattende het epitope van belang.

Polystyreen FACS-buisjes van vijf milliliter, peptide-geladen klasse twee targets voor de visualisatie van antigeenspecifieke T-cellen; anti-CD3, anti-CD4 en anti-CD25 antilichamen voor het coaten van antigeenspecifieke T-cellen. FACS Caliber flowcytometer of een gelijkwaardig apparaat. Verzamel alle materialen en apparatuur op uw werkplek voordat u met de procedure begint.

De volgende demonstratie zal de volgende stappen behandelen: PBMC-isolatie, scheiding van CD4-positieve T-cellen, in vitro expansiecultuur en het visualiseren van T-cellen via TEM of kleuring. Stap één: PBMC-isolatie.

Neem een bloedmonster. Het bloed dient te worden verzameld in spuiten of bloedbuisjes en te worden anticoaguleerd met heparine in een verhouding van 1:50 om stolling te voorkomen; ga uit van een opbrengst van ongeveer 1 miljoen PBMC per milliliter bloed. Hiervan zal ongeveer 40% bestaan uit CD4-positieve T-cellen.

Verdeel het bloed over 50 milliliter conische buizen. 25 milliliter bloed per buis. Meng het bloed voorzichtig vóór de ALI-stolling om het plasma te verdelen.

Voeg PBS toe tot een totaalvolume van 40 milliliters en creëer een onderlaag door 11 milliliters uit een flacon in een bloedbuis te brengen en de pipetbegeleider voorzichtig van de pipet te verwijderen. De flacon zal langzaam leeglopen in de bodem van de buis. Zodra het niveau is gelijkgetrokken, wordt de pipet langzaam uit de bloedbuis verwijderd, worden de bloedbuizen afgesloten en worden deze naar de aerosolbusjes verplaatst.

Sluit de canisters stevig en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 900 ×g zonder rem. Het is essentieel dat er aan het einde van deze centrifugeerstap geen rem wordt toegepast, aangezien de remkracht de cellaag na het centrifugeren zou kunnen verstoren. De pbmc moeten een duidelijke witte laag vormen tussen het gele plasma erboven en de transparante vloeistof eronder.

Verwijder voorzichtig de laag met witte bloedcellen met een transferpipet en breng deze over naar een nieuwe buis. Er kan wat plasma en feces worden meegezogen met de pbmc, maar vermijd het opzuigen van de laag met rode cellen. Gewoonlijk kunnen in deze stap twee bloedbuizen worden samengevoegd in één celbuis.

Om de grootte van het pellet te vergroten, voegt u PBS toe tot een totaalvolume van 15 milliliters en centrifugeert u 15 minuten lang bij 500 ×g met een lage remvertraging; aspireer de vloeistof met een Pasteurpipet, waarbij u er zorg voor draagt dat het pellet niet wordt verstoord. Behandel met hemolytische buffer door vijf tot zes milliliters aan elke buis toe te voegen en voorzichtig te mengen om klonten te verwijderen. Incubeer gedurende maximaal vijf minuten.

Voeg PBS toe tot een totaalvolume van 50 milliliters en centrifugeer bij 230 ×g gedurende 10 minuten. Bij een lage remkracht zijn aerosol-beschermkappen voor deze langzamere centrifugaties niet langer nodig. Was twee keer door de vloeistof af te zuigen met een Pasteur-pipet, de buis te vullen met PBS en bij 230 ×g gedurende 10 minuten te centrifugeren vóór de laatste wasstap; neem een aliquot van de resuspendeerde cellen, verdun deze met trypancristalblauw en tel ze met een hemocytometer.

Deze celtelling bepaalt de hoeveelheden reagentia die worden gebruikt bij de T-celseparatie. Stap twee, separatie van CD4-positieve T-cellen: aspireer de vloeistof en voeg running buffer toe om het totale volume aan te vullen tot 40 µL per 10 miljoen cellen. Normaal gesproken vereist dit 30 µL buffer plus het resterende pelletvolume.

Breng dit volume over naar een conische buis van 15 milliliter. Voeg de antilichaamcocktail van de CD four isolatiekits toe, 10 µL per 10 miljoen cellen. Sluit de buis en plaats deze gedurende 10 minuten op ijs. Haal de buis van het ijs, verwijder de dop en voeg 30 µL running buffer per 10 miljoen cellen toe.

Voeg magnetische beads van de CD four isolatiekit toe. Gebruik 20 µL per 10 miljoen cellen, sluit de buis en plaats deze gedurende 15 minuten op ijs. Voeg 10 volumes running buffer toe om te wassen en centrifugeer 10 minuten bij 230 ×g.

Stel tijdens het centrifugeren de magneet en een polypropyleen buis van vijf milliliter klaar op uw werkplek. Aspireer de vloeistof van het celpellet. Voeg twee milliliters loopbuffer toe en verwijder klontjes met een transferpipet.

Breng met dezelfde transferpipet de cellen over in de buis van vijf milliliter en incubeer deze 15 minuten in de magneet. Schenk de CD4-positieve T-cel-fractie voorzichtig over in een gemarkeerde buis van 15 ml door de magneet om te keren en alles tot op de laatste druppel te legen. Voeg nog twee milliliter running buffer toe aan de buis van vijf milliliter en verwijder deze uit de magneet.

Spoel de vier negatieve CD4-cellen voorzichtig van de wanden van de buis af en breng deze over naar een gemarkeerde buis van 15 ml. Voeg twee milliliter T-celmedium toe aan elke buis. Neem aliquaten af voor het tellen van de cellen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 230 ×g.

Verdun celaliquots met trypanblauw en tel deze met een hemocytometer. Deze celtellingen bepalen het aantal wells dat wordt gebruikt voor de expansiecultuur. Stap drie.

Zuig bij de in vitro expansiecultuur de vloeistof af van de CD4-positieve en CD4-negatieve celpellets op basis van de celaantallen. Voeg medium toe aan de CD4-positieve cellen om het volume aan te passen naar 3 miljoen cellen per ml. Voeg medium toe aan de CD4-negatieve cellen om het volume aan te passen naar 10 miljoen cellen per ml.

Voor de expansiecultuur zijn 3 miljoen CD4-negatieve cellen per putje en 2 tot 3 miljoen CD4-positieve cellen per putje nodig. Meestal vormen de CD4-positieve cellen de beperkende populatie. Verdeel de CD4-negatieve cellen over het juiste aantal putjes op een 48-wells plaat.

Voeg 300 µL toe aan elke put en plaats de plaat gedurende één uur in een incubator bij 37 °C. Haal de plaat uit de incubator en was de putten door 500 µL vers medium toe te voegen, dit 12 tot 20 keer voorzichtig met een transferpipet op en neer te pipetteren en vervolgens alle vloeistof te verwijderen. Deze wasstap laat een laag adherente antigeenpresenterende cellen achter.

Wanneer het wassen voltooid is, voegt u precies genoeg medium toe om de bodem van elke well te bevochtigen, ongeveer 100 µL. Anders zullen de adherente cellen uitdrogen. Voeg indien nodig twee tot 3 miljoen CD4-positieve cellen toe aan elke well.

Voeg extra medium toe om het totale volume in elke put aan te vullen tot één milliliter. Voeg het gewenste peptide toe aan elke put. De typische concentratie voor stimulatie is 10 µg per milliliter.

Plaats de plaat tot slot gedurende zeven dagen in een incubator op 37 °C. Voeg na zeven dagen op elke volgende dag 50 µL hemo IL twee toe aan elke put.

Controleer de celgroei met behulp van een microscoop; voor wells die nog niet confluent zijn, verwijdert u de helft van het medium en voegt u vers medium en 50 µL IL-2 toe. Split confluente wells door de cellen te resuspenderen en de helft van de cellen naar een lege well te verplaatsen. Voeg vers medium en 50 µL IL-2 toe en plaats de cellen terug in de incubator. De expanderende cellen zijn na 13 tot 15 dagen kweek gereed voor teer-kleuring.

Stap vier, visualisatie van T-cellen door middel van tetramerkleuring, koop of stel tetrameren samen die passen bij de peptide-MHC-combinaties die zijn gebruikt om de CD4-positieve T-cellen te stimuleren. Haal de plaat uit de incubator.

Zuig voorzichtig de helft van het medium uit elke well af. Breng een aliquot cellen uit elke well over, doorgaans 75 µL of ongeveer 50.000 cellen, in een vijf milliliter polystyreen Fax-buis; voeg teer toe, doorgaans 1 µL per 50 µL totaal volume, en plaats dit gedurende één uur in een incubator bij 37 °C. Het is daarnaast raadzaam om een tweede aliquot van elke well te kleuren met een niet-passende teer als negatieve controle. Label de cellen met anti-CD3, anti-CD4 en anti-CD25 antilichamen.

Aanvullende of alternatieve antilichaammarkers kunnen worden gebruikt. Gebruik echter geen PE-gelabelde antilichamen, aangezien dit kanaal op dit moment gereserveerd moet blijven voor de teams. Label daarnaast alle enkelkleur- of isotypecontroles met extra cellen.

Incubeer de met antilichamen gelabelde cellen gedurende 15 tot 30 minuten bij 4 °C. Was elke buis met 0,5 tot 1 mL loopbuffer en centrifugeer 10 minuten bij 230 ×g. Schenk de vloeistof voorzichtig uit de buizen af, kalibreer de flowcytometer met referentiekralen, enkelkleur-controlebuizen, isotype-controles, enzovoort.

Analyse elke buis met de flowcytometer. De tetra-positieve cellen zouden een aparte populatie moeten vormen binnen de geëxpandeerde CD4-positieve T-cellen. Tetra-positieve cellen zijn gewoonlijk CD25-positief en vaak CD4-hoog.