Een techniek om tegelijkertijd Visualiseer virus-specifieke CD8 + T-cellen en virus-geïnfecteerde cellen In situ

Door in situ hybridisatie en tetramer-kleuring te combineren in een techniek die bekend staat als ISTH, kunnen de relatieve aantallen en ruimtelijke relaties tussen immuuneffectorcellen die specifiek zijn voor virale antigenen en viraal geïnfecteerde cellen en weefsels worden bepaald. ISTH begint met het inbedden van vers SIV-geïnfecteerd weefsel in agarose. Het weefsel wordt met een vibratoom in secties van 200 micron dik gesneden en gekleurd voor viraal antigeen.

Specifieke CD8-positieve cellen met behulp van FITC-gelabelde MHC-tetrameren. Na het invriezen worden deze gekleurde coupes verder gesneden in coupes van 8 µm dik met een cryostaat en wordt in situ hybridisatie uitgevoerd om viraal geïnfecteerde cellen te lokaliseren. Confocale microscopie wordt gebruikt om de dubbelgekleurde coupes te beeldvormen en uiteindelijk de oorspronkelijke dikke coupes te reconstrueren om de relatie tussen immune effectorcellen en doelcellen bloot te leggen.

Het gebruik van deze procedure voor het onderzoeken van vroege SIV-infectie is een goede voorspeller gebleken voor de ernst van de daaropvolgende ziekte. Hallo, ik ben Chinen Lee van de onderzoeksgroep van Ashley HA in de afdeling Microbiologie aan de University of Minnesota. Ik ben Pam Skinner, universitair docent in de afdeling Veterinair Biomedische Wetenschappen aan de University of Minnesota.

Vandaag laten we u een procedure zien voor in situ tetrameerkleuring gecombineerd met in situ hybridisatie, afgekort ISTH. Naast het gebruik van in situ tetrameerkleuring in combinatie met in situ hybridisatie, zoals we vandaag demonstreren, maken we routinematig gebruik van in situ tetrameerkleuring in combinatie met immunohistochemie om de locatie, abundantie en het eiwitexpressieprofiel van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen in situ te bepalen. Dr. Heon Kim en Terry Matala zullen ons vandaag helpen bij de in situ tetrameerkleuring van de dikke coupes, en So zal ons ondersteunen bij de preparatie van dunne coupes en de in situ hybridisatie. Laten we beginnen.

Om deze procedure te starten, koelt u het Vibram-bad met steriele PBSH af tot 2 °C. Stel de hoek van het trilmes in op 27 graden. Houd vers weefsel waar mogelijk gekoeld op ijs en begin de procedure binnen 24 uur na het oogsten van de weefsels.

Om degradatie door koeling te minimaliseren, wordt het weefsel vers gesneden, wordt bindweefsel weggesneden en wordt het specimen met een scalpel in kleine stukjes gesneden; plaats de stukjes in een whey boat en bedek deze met 4% low melt agarose in PBS, gesmolten bij ongeveer 40 °C. Zorg ervoor dat het weefsel contact maakt met de bodem van de schaal en druk weefselstukjes naar beneden als ze drijven, en laat het geheel drie tot vijf minuten op ijs stollen.

Hier wordt miltweefsel gebruikt, maar lymfeklieren, vagina, cervix, uterus of andere verse weefsels kunnen ook met een scalpel worden gebruikt. Snijd de agros rondom het weefsel en breng het in agros ingebedde weefsel met een pincet zorgvuldig over naar het weefselblok. Ga verder door een Vibram-weefselblok te voorzien van Loctite-lijm.

Verplaats het stuk weefsel niet zodra het op het weefselblok is geplaatst. Laat het ongeveer 10 minuten op ijs drogen. Plaats vervolgens het weefselblok in de vibratoom en snijd het weefsel in secties van 200 micrometer dik, met een zeer lage voorwaartse snelheid en een relatief hoge amplitude.

Gebruik een penseel om de gesneden coupes over te brengen naar een gespecialiseerde weefselkamer die is geplaatst in de well van een 24-wells weefselkweekplaat, vooraf gevuld met één milliliter gekoelde PBSH. Plaats maximaal vier weefselcoupes in elke weefselkamer. Label de monsters en bevestig het deksel op de plaat met een elastiek om de weefselcoupes te kleuren voor virus-specifieke T-cellen.

ZI-geconjugeerde tetrameren worden eerst verdund in blokkeringsbuffer tot een concentratie van 0,5 micrograms per milliliter. De oplossing wordt met een pipet in een 24-well plaat aangebracht, met één milliliter per well. Het vers gesneden weefsel wordt overgebracht naar de weefselkamers in de plaat en mag een nacht schudden bij vier degrees Celsius.

Houd een lege well vrij tussen weefselkamers met verschillende monsters om kruiscontaminatie van oplossingen in volgende stappen te voorkomen. In deze stap kunnen antilichamen worden toegevoegd die gericht zijn tegen extracellulaire eiwitten of eiwitten op het celoppervlak. Bereid voor het wassen een 24-well weefselkweekplaat voor met gekoelde PBSH na de primaire incubatie.

Was twee keer door de weefkamerjes gedurende telkens 20 minuten over te brengen naar een vooraf gevulde plaat; zorg ervoor dat het grootste deel van de vloeistof uit de weefkamerjes wordt afgevoerd vóór het overbrengen. Pas daarnaast op dat er geen inhoud van het ene monster in het andere druppelt bij het verplaatsen van de weefkamerjes en controleer de coupes in de weefkamerjes om er zeker van te zijn dat ze niet aan de wanden blijven kleven. Fixeer de coupes na de fixatie gedurende twee uur bij kamertemperatuur met verse 4%paraldehyde in PBS.

Was twee keer met koude PBSH gedurende vijf minuten per keer om het signaal van de tetrameren te versterken. Incubeer de coupes met konijnen anti-fitzy-antilichamen in een verhouding van 1:10.000 in blokkeringsbuffer gedurende één tot drie dagen. In deze fase kunnen antilichamen tegen intracellulaire epitopen worden toegevoegd.

Zorg ervoor dat de cellen worden gepermeabiliseerd en dat aspecifieke bindingsplaatsen worden geblokkeerd vóór de toevoeging van het antilichaam. Antigeenherstel kan tevens vereist zijn na de tweede lange incubatie die bedoeld is om het signaal te versterken. Was de coupes drie keer in PBSH gedurende ten minste 20 minuten en tot meerdere uren per keer.

Voer een laatste incubatie uit met geschikte fluorescentielabelde antilichamen. Men kan bijvoorbeeld geit anti-konijn SI drie gebruiken om de konijn anti-fitzy-antilichamen te binden, zodat de tetrameerkleuring van de cellen rood fluorescent wordt. Indien muizenantilichamen zijn gebruikt om eiwitten van belang te tegenkleuren, zoals CD acht om killer T-cellen te visualiseren, kan men geit anti-US Alexa 488 gebruiken om aan de muizenantilichamen te binden en de antilichamenkleuring van de cellen groen fluorescent te maken; verdunningen van elk antilichaam moeten empirisch worden bepaald.

Incubeer gedurende één tot drie dagen; houd de coupes beschermd tegen licht door de platen tijdens deze incubatie en daarna in aluminiumfolie te wikkelen, aangezien licht de fluorescentie doet wegvallen. Fixeer de coupes tot slot opnieuw om de tetrameren en de antilichamen op hun plaats te borgen. Was en monteer op een microscoopglaasje met glycerol-gelatine bevattend 4 mg/mL N-propylgallaat voor bewaring bij -20 °C totdat de dunne coupes voor in-situ hybridisatie worden geprepareerd.

De coupes met in situ tetrameerkleuring kunnen nu worden geanalyseerd met een confocale microscoop om de lokalisatie, abundantie en het eiwitexpressiepatroon van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen te bepalen. In de getoonde afbeelding zijn coupes van miltweefsel van een SIV-geïnfecteerde rhesusmacaak gekleurd met gag-tetrameren om SIV-specifieke CD8+ T-cellen te labelen, samen met CD20-antilichamen en CD3-antilichamen. Aangezien de tegenkleuring met antilichamen in de volgende stap verloren gaat, is het belangrijk om de in situ tetrameren te analyseren voordat men verder gaat.

Begin de procedure voor het maken van dunne coupes door de 200 micron dikke coupes vijf minuten lang op 70 °C te verhitten op een warmteblok om de dikke coupes van de objectglas te laten loslaten. Zodra de coupes zijn losgekomen, kunnen ze in OCT op droogijs worden ingebed door eerst de bodem van de plastic mal te vullen met OCT. Plaats vervolgens het weefsel bovenop het OCT en bedek het met OCT.

Gebruik een cryostaat om coupes van acht micron dikte te snijden uit de in OCT ingebedde secties en breng de coupes van acht micron aan op gesiliciseerde objectglazen. De objectglazen kunnen vervolgens worden bewaard bij minus 80 °C in een afgesloten doos voor latere in situ hybridisatie. Standaard in situ hybridisatie wordt gebruikt om viraal geïnfecteerde cellen te detecteren via S 35 gelabelde virus-specifieke rib-probes.

De procedure omvat ook het coaten van coupes met nucleaire sporenemulsie en het monteren van objectglazen. In een fluorescentie-compatibel paramount medium worden confocale beelden verkregen met een BioRad MRC 1000 confocale microscoop, die is uitgerust met een epi tube blue reflectieapparaat. De in situ tetramerkleuring wordt gevisualiseerd met de EPI one 605 voor het rode tetramer fluorochroom en EPI 2 522 DF 32 voor het groene CD8 fluorochroom voor in situ hybridisatie.

Gebruik de EPI two blue reflection voor de zilverkorrels die voortkomen uit het in-situ hybridisatiesignaal in de ontwikkelde radiografieën. Om de beeldacquisitie te starten, neemt u de beelden van elke sectie van links naar rechts en van boven naar beneden op, en zorg ervoor dat elk beeld een overlap van ongeveer 20% heeft met de aangrenzende beelden. Om gaten in het gereconstrueerde montagebeeld te voorkomen, benoemt u elk beeld volgens de rij en kolom in een Excel-bestand.

Wanneer de gegevensverzameling van de coupes is voltooid, gebruik dan de confocal assistant-software om Z-seriebeelden voor elk kanaal te projecteren tot één enkel beeld met behulp van een Photoshop seven actieprocedure die verkrijgbaar is via de auteurs, en voeg het geprojecteerde beeld van de drie kanalen automatisch samen tot één RGB-beeld. Voeg vervolgens de samengevoegde beelden in lagen aan elkaar om een montagebeeld van de gehele sectie te genereren. Koppel individuele zilerkorrels en tetrameerkleuring aan cellen in de montage met behulp van metamorph of Photoshop.

Wijs de XY-coördinaten toe aan de centra of OID's van de viraal RNA-positieve en tetrameer-positieve cellen. Exporteer de OID-gegevens naar Excel-bestanden als numerieke waarden voor elke cel en gebruik de in de Excel-bestanden verzamelde gegevens om de ratio's van immuuneffector- of e-cellen ten opzichte van virale targets of T-cellen te bepalen op basis van de totale aantallen tetrameer-positieve en viraal RNA-positieve cellen in de sectie, om zo de ruimtelijke relaties tussen tetrameer-positieve en RNA-positieve cellen vast te leggen. Kopieer en plak de respectievelijke plots uit de Excel-bestanden in een Photoshop-document in Photoshop.

Verlaag de opaciteit van een laag om de rasters uit te lijnen en te schalen zodat ze samenvallen qua kleur, selecteer deze en kopieer en plak ze vervolgens in een nieuwe laag. De posities van de blauwe RNA-positieve cellen; verwijder de laag die is gebruikt om de rasters uit te lijnen, waarna de posities van de tetrameer-positieve en virale RNA-positieve cellen in het platgeslagen beeld zichtbaar worden. Met behulp van de hier getoonde ISTH-methode zijn wij in staat de immuunrespons op SIV-infectie te volgen na intravaginale inoculatie bij deze toegangspoort en in de lymfatische weefsels waarnaar de infectie zich verspreidt.

Op 10 dagen na infectie zijn er grote aantallen geïnfecteerde cellen op deze weefselplaatsen, maar zelfs drie dagen later zijn er wel groen gekleurde CD A-positieve cellen, maar nog geen rood gekleurde SIV-specifieke tetra-positieve cellen. De immuunrespons is dus te laat om de infectie te klaren.

Echter, drie weken na infectie is een afname van geïnfecteerde cellen duidelijk zichtbaar, vooral bij de toegangspoort. We gebruikten ISTH om aan te tonen dat de mate van reductie correleerde met de ruimtelijke nabijheid en de relatieve aantallen tetrameer-positieve immuuneffectorcellen ten opzichte van N-S-I-V-R-N-A-positieve doelcellen; we noemen dit de in vivo E:T-ratio.

De ruimtelijke relaties zijn met deze methode eenvoudig te visualiseren, waarbij de effectorcellen in rood en de virale targets in blauw zijn weergegeven in deze geïnfecteerde lymfeknoop. Veel effector- en targetcellen bevinden zich in nauwe nabijheid en er zijn gebieden waar veel effectorcellen een enkele S-I-V-R-N-A-positieve cel omringen, terwijl in andere gebieden een S-I-V-R-N-A-positieve cel alleen staat. De E:T-ratio wordt eenvoudig berekend zodra de posities van de cellen zijn bepaald en de aantallen van elk type in het Excel-bestand zijn gelogd.

De beste beheersing van de virale infectie correleert met een groot overschot aan rode effectoren ten opzichte van groene targets, 43 op één. In dit geval waren de ETT-ratio's in de lymfeklieren lager dan in de cervix en vagina, waar de infectie begon. De positieve correlatie tussen hoge ETT-ratio's en de afname van de virale load vanaf de piek geeft aan dat een robuustere immuunrespons bij de toegangspoort leidt tot een betere beheersing van de infectie.

We hebben zojuist aangetoond hoe de zeer specifieke CDAT-cellen en de virusgeïnfecteerde cel gelijktijdig in situ kunnen worden gedetecteerd. Deze techniek stelt ons in staat om antigeenspecifieke T-cellen en virusgeïnfecteerde cellen in weefsels gelijktijdig te visualiseren. Deze techniek kan worden toegepast om CD8+ T-cel-gebaseerde vaccins en andere interacties tussen pathogenen en de gastheer te evalueren bij het uitvoeren van deze procedure.

Het is belangrijk om alle reagentia RNase-vrij te houden voorafgaand aan de in situ hybridisatie. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.