Het meten van replicatieve levensduur in de gist

De buddinggist Croce Visi is uitgebreid gebruikt om de biologie van veroudering te bestuderen. In dit artikel presenteren we een algemeen protocol voor het meten van de replicatieve levensduur van gistmoedercellen. Hallo, ik ben Kristen Steffen van het laboratorium van Brian Kennedy van de afdeling Biochemie aan de University of Washington.

Vandaag laten we u een procedure zien voor het meten van de replicatieve levensduur van gistmoedercellen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om genen te bestuderen die de levensduur van gistcellen beïnvloeden. Laten we beginnen.

Voor het experiment naar de replicatieve levensduur en de voorbereiding van gistcellen voor de levensduuranalyse moeten vaste YEPD-platen worden klaargemaakt. Gebruik de juiste steriele techniek om deze YEPD-agarplaten te bereiden. Bereid ten minste twee platen voor elke vier tot vijf stammen die in het levensduurexperiment worden geanalyseerd.

Deze platen moeten ten minste twee dagen voor het levensduurexperiment worden bereid en voor het begin van de levensduurassay volledig zijn opgedroogd. Als het experiment niet binnen vier tot vijf dagen na het gieten van de platen plaatsvindt, moeten ze worden omwikkeld met parafilm of plastic en in een gekoelde incubator worden geplaatst om uitdroging te voorkomen. Haal de giststammen uit de bevroren voorraden en ent ze uit voor enkelvoudige kolonies.

Op de YEPD-agarplaten. Tot zes stammen kunnen eenvoudig op dezelfde YEPD-plaat worden uitgestreken door de plaat te verdelen in gelijkmatig grote taartpunten. Incubeer de cellen gedurende twee dagen bij 30 °C.

Haal na incubatie de cellen uit de incubator en zaai cellen van een enkele kolonie over op een verse YEPD-plaat. Op dit moment moeten de te analyseren stammen worden gecodeerd om te garanderen dat het experiment naar de replicatieve levensduur blind wordt uitgevoerd, waarbij de personen die de dissecties uitvoeren de identiteit van de individuele stammen niet kennen.

Incubeer vervolgens de gepatchte gecoate cellen bij 30 °C tot de volgende avond. Neem de cellen weg en patch vanuit elke gecoate stam lichtjes cellen naar nieuwe YEPD-platen. Deze zullen dienen als de experimentele platen die worden gebruikt voor de replicatieve levensduur.

Analysecellen moeten langs een verticale lijn aan de linkerkant van de YEPD-plaat worden aangebracht. Breng niet te veel cellen over naar één enkele verse YEPD-plaat. Aangezien dit zal leiden tot een dikke groei van de cellen tijdens de incubatie gedurende de nacht en hun replicatieve levensduur zal beïnvloeden, is ongeveer drie tot vijf patches per plaat optimaal.

Uitgaande van het feit dat de replicatieve levensduuranalyse zal worden uitgevoerd op 20 cellen per patch, is het levensduurexperiment nu volledig opgezet en is het enige wat nog moet gebeuren het overnacht incuberen op het aanrecht. Morgen kunnen we vervolgens beginnen met de microdissectie om de gistcellen op de plaat te positioneren en maagdochtercellen te verkrijgen voor de replicatieve levensduuranalyse.

Gebruik een microscoop die is uitgerust met een microdissectie-apparaat dat geschikt is voor gist. Draag ongeveer 50 cellen van de eerste patch-stam over naar een positie op de plaat die ver verwijderd is van de gepatchte cellen. Als uw microscooptafel is gegradeerd, kunnen deze gradaties worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de cellen tijdens volgende iteraties gemakkelijk te vinden zijn.

Soms kunnen cellen in de naald vast komen te zitten, wat problematisch kan zijn als ze op het verkeerde moment vrijkomen. Om er zeker van te zijn dat de naald schoon en vrij van cellen is, tikt u deze herhaaldelijk tegen het agar-oppervlak. Maak vervolgens een gaatje in de agar door de naald met kracht door het agar-oppervlak te duwen.

Dit gat dient als markering om u te oriënteren op de plaat tijdens opeenvolgende iteraties van dissectie en het verwijderen van dottercellen. Zorg ervoor dat er geen gistcellen in het gat terechtkomen, anders zullen deze groeien en een kolonie vormen direct boven het gat. Plaats individuele gistcellen verticaal uitgelijnd in 20 gelijkmatig verdeelde posities, met één tot drie naaldiameters tussen elke celpositie.

Plaats voor elke paar cellen twee cellen naast elkaar op dezelfde positie in de lijn in plaats van één. Dit maakt redundantie mogelijk tijdens de selectie van maagdelijke dochtercellen. Als een van de overgeplaatste cellen niet divideert tussen de 10e en 11e positie in de lijn, maak dan een horizontale reeks van zeven tot acht gaatjes in de agar.

Dit dient als markering om u te oriënteren op de plaat tijdens opeenvolgende dissecties en het verwijderen van dochtercellen. Wees opnieuw voorzichtig dat er geen gistcellen in de gaatjes terechtkomen, anders zullen deze groeien en een kolonie vormen. Herhaal deze procedure voor elk vlak op de plaat en blijf de cellen verticaal langs dezelfde as ordenen.

Het is belangrijk om bij het maken van het gat in het AER erop te letten dat het aantal gaten overeenkomt met het patchnummer, zodat er één gat is voor de eerste patch en twee gaten voor de tweede. Zodra de cellen voor elke patch zijn opgesteld, dient de plaat geparaformeerd te worden en ongeveer twee uur te worden geïncubeerd bij 30 °C. Onthoud dat vanaf dit punt alle platen met Parafilm moeten worden afgedekt, behalve tijdens de dissectie.

Om uitdroging te voorkomen, wordt deze procedure voor elke plaat herhaald. In het experiment. Voor de analyse van de levensduur is het belangrijk om er zeker van te zijn dat elke cel start als een maagdelijke dochtercel.

Haal hiervoor eerst de platen uit de incubator en controleer of de meeste cellen in de array een celdeling hebben ondergaan. Wat we hier hebben, zijn cellen die eerder zijn uitgelijnd, en u kunt zien dat ze na twee uur in de incubator zijn begonnen met delen. We hebben nu een moedercel, de grotere cel die verbonden is met het lichaam, en de nieuwe dochtercel; deze dochtercel is de cel die zal worden gebruikt om de levensduurmeting te starten.

Als er extra tijd nodig is om de celdelingen te laten voltooien, plaats de plaat dan terug in de incubator. Begin bij de eerste cel van de array. Gebruik de naald om dochtercellen van de moedercel te scheiden door de naald voorzichtig op de aanhechtende cellen te plaatsen.

Het kan soms nuttig zijn om tegen de zijkant van de microscoopvoet te tikken terwijl de naald op de cellen rust. Plaats vervolgens de losgekoppelde dochtercel in de verticale lijn van cellen ter vervanging van de moedercel en eventuele extra dochtercellen, en schuif deze tijdelijk opzij. Herhaal deze stappen voor elke cel in het array.

Als een cel zich niet splitst, neem dan een dochtercel van een van de redundante cellen die naast de testcel zijn geplaatst. Na voltooiing moet u 20 dochtercellen hebben voor elke verticaal uitgelijnde patch op de levensduurplaat. Verzamel alle moedercellen en extra dochtercellen in een groep en breng ze terug naar een gebied nabij de patches, het zogenaamde kerkhof.

Het is belangrijk om ongewenste cellen ver weg te houden van de cellen die ondergaan van levensduuranalyse om de vorming van microkolonies en de uitputting van lokale voedingsstoffen te voorkomen. Zodra de cellen zijn gescheiden, worden ze van de plaat verwijderd en ongeveer twee uur geïncubeerd bij 30 °C. Herhaal deze stappen voor elke plaat in het experiment.

Om de replicatieve capaciteit van individuele cellen te meten, moet u levensduur-gegevensbladen voorbereiden. Een levensduur-gegevensblad kan een eenvoudig raster zijn waarbij elke rij overeenkomt met een individuele moedercel en elke kolom met een tijdstip in de levensduur. Zorg ervoor dat elk gegevensblad wordt gelabeld op basis van het aantal stammen dat wordt geanalyseerd.

Begin hiermee door de platen uit de incubator te halen en te controleren of de meeste cellen in de array ten minste één celdeling hebben ondergaan. Als er extra tijd nodig is om de celdeling te voltooien, plaats de plaat dan terug in de incubator. Begin bij de eerste arraycel op de eerste plaat en observeer visueel de moedercel en de dochtercel(len) om het aantal celdelingen te bepalen dat heeft plaatsgevonden.

Het is over het algemeen eenvoudig vast te stellen hoeveel dochtercellen een moedercel heeft geproduceerd op basis van karakteristieke patronen in de celarrangementen. Bij deze is het zeer eenvoudig te zien hoeveel cellen er zijn geproduceerd, omdat er twee aanwezig zijn die dezelfde grootte hebben en beide kleiner zijn dan de moedercel. Noteer het aantal door de moedercel geproduceerde dochtercellen in het juiste vak op het scoreblad voor de levensduur.

Gebruik vervolgens de naald om de dochtercellen los te maken van de moedercel, zoals eerder beschreven, door de naald voorzichtig op de aanhechtende cellen te plaatsen en tegen de zijkant van de microscoopvoet te tikken terwijl de naald op de cellen rust. Houd de moedercel op zijn positie in de verticale lijn en verplaats de dochtercel of dochtercellen tijdelijk opzij. Herhaal deze stappen voor elke cel in de array.

Verzamel tot slot alle weggegooide dochtercellen en verplaats deze naar de 'graveyard' vlakbij de oorspronkelijke patches. Verslind de plaat met Parafilm en incubeer deze bij 30 °C gedurende twee tot drie uur. Herhaal het weggooien van dochtercellen en de incubatie.

Stap voor elke plaat in het experiment. Herhaal deze volledige procedure totdat alle moedercellen zijn gestopt met delen. Houd er rekening mee dat naarmate de moedercellen ouder worden, de voortgang van de celcyclus vertraagt en het wenselijk zal zijn om de plaat tussen de leeftijdspunten door gedurende langere perioden te incuberen; daarna kunnen de platen gedurende de nacht bij vier graden Celsius worden bewaard.

De ruwe gegevens die voortvloeien uit een experiment naar de replicatieve levensduur bestaan uit een lijst met getallen die overeenkomen met de dochtercellen die door elke moedercel op elk tijdstip van de leeftijd zijn geproduceerd, zoals hier te zien is. Door elke rij van het scoreblad op te tellen, wordt de replicatieve levensduur voor elke moedercel verkregen.

Gegevens van andere cellen uit dezelfde experimentele groep kunnen worden samengevoegd om een overlevingscurve te genereren en statistische berekeningen uit te voeren. De curve moet globaal consistent zijn met de Gompertz-kinetiek, waarbij een sigmoïdale vorm zichtbaar is met een lage vroege mortaliteit, gevolgd door een relatief snelle daling in de overleving en een afvlakking van de curve op latere leeftijden. We hebben zojuist laten zien hoe u een experiment naar de replicatieve levensduur van gist uitvoert.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de cellen zich blijven delen zodra ze niet in de kou staan. Vergeet daarom niet de plaatjes een nacht bij vier graden te bewaren, zodat u 's ochtends niet geconfronteerd wordt met te veel dochtercellen om te tellen. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.