Studeren Age-afhankelijke genomische instabiliteit met behulp van de S. cerevisiae Chronologische levensduur Model

Het algemene doel van deze procedure is om leeftijdsafhankelijke genomische instabiliteit in gist te bestuderen door de chronologische levensduur te combineren met een reeks eenvoudige assays voor DNA-schade en mutaties. Dit wordt bereikt door eerst elke twee dagen monsters te nemen van chronologisch verouderende culturen en de levensvatbaarheid te controleren via colony forming unit of CFU-vorming. De volgende stap van de procedure is het onderzoeken van DNA-mutaties door monsters te nemen van verouderende culturen en de cellen uit te platen op een mutatiespecifiek selectiemedium.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in DNA-mutaties tijdens de chronologische veroudering van gist aantonen door de resultaten van de mutatieanalyse te normaliseren ten opzichte van de levensvatbaarheid. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het verouderingsonderzoek, zoals de mechanismen die veroudering en genomische instabiliteit met elkaar verbinden. Om de chronologische levensduur of CLS van gist te bepalen, inoculeert u eerst een enkele gistkolonie in één milliliter synthetisch compleet glucose-medium, of SDC-medium, en incubeert u dit gedurende de nacht onder schudcondities bij 30 °C. Verdun de overnight-cultuur de volgende dag in 10 milliliter vers SDC-medium tot een OD 600 van 0,05 tot 0,1 en incubeer dit drie dagen lang onder schudcondities bij 30 °C.

Op dag drie, wanneer de cellen zich in de stationaire fase bevinden, wordt elk Eloqua 10.000 keer verdund in autoclaafwater. Neem vervolgens twee aliquots van 10 µL uit de kolf en plaatst 10 µL van elke verdunde cultuur op een A-Y-E-P-D plaat. Incubeer de plaat bij 30 °C totdat er kolonies ontstaan. Het aantal ontstane kolonies of colony forming units uit de cultuur van dag drie wordt beschouwd als 100% overleving.

Ga door met het wegnemen van aliquoten uit de verouderende cultuur op opeenvolgende dagen voor het uitplaten. Pas de verdunningsfactoren dienovereenkomstig aan om ongeveer 20 tot 100 kolonies in de CFU-assay te waarborgen. De bemonstering wordt gestopt wanneer de levensvatbaarheid van de cultuur is gedaald tot onder de 1% (typisch tussen dag 11 en 13); de cellevensvatbaarheid kan ook worden bestudeerd in cellen die op platen zijn verouderd.

Om deze assay te starten, inoculeert u een enkele kolonie in één milliliter synthetisch compleet glucosemedium en incubeert u dit gedurende de nacht onder schudcondities bij 30 °C. Wanneer de cultuur is gegroeid tot ongeveer 10⁸ cellen per milliliter, verdunt u de cultuur met autoclaafwater tot 100 tot 200 cellen per 10 µL en 1000 cellen per 10 µL. Bereid voor elke stam een set van acht tot 20 tryptofaan-dropout SDC-platen voor, gelabeld volgens de uitplaatdichtheid.

Om ervoor te zorgen dat 10 tot 100 kolonies kunnen worden geteld, rekening houdend met de afnemende levensvatbaarheid tijdens het verouderingsproces, plaatst u twee aliquoten van 10 tot 30 µL van de verdunde cultuur op elke plaat. Incubeer de set platen bij 30 °C gedurende de duur van de levensduuranalyse. Verwijder op de dag van het uitplaten en vervolgens elke twee dagen één plaat en voeg druppelsgewijs 0,5 mL tryptofaan toe om de levensvatbare cellen te laten groeien. Incubeer de plaat nog eens 48 tot 72 uur bij 30 °C.

Na 48 tot 72 uur. Tel de CFU om de levensvatbaarheid op de dag van tryptofaan-toevoeging te bepalen voor het analyseren van DNA-schade en mutatiefrequentie tijdens chronologische veroudering. Een aantal stammen met speciale kenmerken worden parallel aan de wildtype-stam gekweekt voor de gist-CLS-assay.

De spontane mutatiefrequentie kan worden geëvalueerd door de frequentie van L-canavanine-resistentie in een chronologisch verouderende cultuur te meten. Mutaties in het CAN1-gen, dat de plasma-argininepermease codeert, maken cellen resistent voor de arginine-analoog L-canavanine. Canavanine-resistente cellen zullen groeien op synthetisch compleet medium-platen zonder arginine, aangevuld met L-canavaninesulfaat. De meting van de TRIP-positieve reversiefrequentie in een stam met een amber-mutatie in de TRIP1-coderende sequentie maakt het mogelijk om de snelheid van base-substitutie tijdens chronologische veroudering van gist te schatten.

Positieve reversiecellen zullen groeien op tryptophan-dropoutplaten. De lyse-negatieve stam EH1-50 bevat een shift van plus vier in het open leesraam, wat resulteert in lysine-auxotrofie, en dit kan worden omgekeerd door kleine insertie- of deletiemutaties. De revertanten zullen worden geselecteerd op lysine-dropoutplaten om grove chromosomale herschikkingen of gcr te detecteren.

Er wordt gebruikgemaakt van een mutante stam waarin HX T 13, gelegen op 7,5 kilobases telomeerzijde van can1 op chromosoom vijf, is onderbroken door een U3-cassette; mutaties in zowel de can1- als de U3-genen maken de cellen respectievelijk resistent tegen L-canavanine en 5-fluororotinezuur. Aangezien de frequentie van puntmutaties in beide genen laag is, biedt de analyse van de frequentie van resistentie tegen zowel L-canavanine als 5-fluororotinezuur een schatting van gcr om het niveau van homologe en niet-homologe recombinatie te monitoren. Tijdens chronologische veroudering worden mutanten gegenereerd die ofwel 100% homologe geïnverteerde herhalingen of 91% homologe herhalingen bevatten.

IRS bij de his3-locus zorgt ervoor dat recombinatie tussen de IRS de expressie van functioneel his3-eiwit mogelijk maakt. Daarom zullen cellen waarin recombinatie heeft plaatsgevonden groeien op histidine-dropoutplaten aangevuld met galactose. Op dag drie, wanneer de cellen zich in de stationaire fase bevinden, wordt een passende hoeveelheid cellen uit elke verouderingscultuur verwijderd.

Aangezien voor alle assays dezelfde procedure wordt gebruikt, wordt er slechts één monster verwerkt. Voor de doeleinden van deze video worden de cellen gepelletteerd door middel van centrifugatie in een tafelcentrifuge. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in één milliliter autoclaafwater pellet.

Verwijder opnieuw het supernatant en resuspendeer de celpellet in 100 µL water; plaat de cellen op de juiste platen om te selecteren op de gewenste reverts. Incubeer de platen bij 30 °C en tel na drie tot vier dagen de CFU's; de mutatiefrequentie wordt genormaliseerd naar het aantal levensvatbare cellen. Deze grafiek toont representatieve resultaten van een typische assay voor de chronologische levensduur, waarbij de chronologische overleving van wildtypecellen wordt vergeleken met die van S CH nine delta TOR one delta en RAs two delta mutanten.

In vloeibare cultuur vertonen mutanten met een tekort aan TOR one s, CH nine of RAs two een verlengde chronologische levensduur. Bovendien vertonen deficiënties in s CH nine en RAs two een additief effect op de bevordering van de levensduur en chronologische overleving in de aanwezigheid van diverse koolstofbronnen. Het gebruik van de NC two levensvatbaarheidsassay wordt getoond in de volgende grafiek.

Op dag één werden SDC wild-type culturen verdund en uitgeplaat op SC trip dropout-platen zonder koolstofbron. SC trip dropout-platen aangevuld met glucose, ethanol of glycerol-oraatplaten werden elke twee dagen geïncubeerd bij 30 °C. Van elke set werd één plaat teruggehaald en er werden passende voedingsstoffen toegevoegd om groei en kolonievorming mogelijk te maken.

De leeftijdsafhankelijke mutatiefrequentie varieert sterk afhankelijk van de stam, de achtergrond, genetische manipulatie, kweek, condities en leeftijd. Deze tabel toont typische resultaten verkregen in een wild-type stam. Representatieve resultaten van translesiesynthese worden getoond in de volgende afbeelding.

De leeftijdsafhankelijke toename van de mutatiefrequentie kan verband houden met veranderingen in foutieve DNA-reparatie met gebruik van nucleaire extracten en diverse DNA-templates. We kunnen de translesiesynthese of TLS evalueren in chronologisch verouderde cellen. Nucleaire extracten van drie dagen oude stationaire fase, wild-type en SCH9Δ-mutante cellen werden geanalyseerd.

TLS-producten met een onbeschadigde template worden aangegeven door doorgetrokken lijnen en TLS-producten met een beschadigde template worden aangegeven door stippellijnen. Er werd geen translesie-synthese waargenomen in nucleaire extracten van de langlevende s CH nine delta-mutant; vrije primers worden aangegeven door de open pijl. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het uitvoeren van chronologische levensduuranalyse en DNA-mutatieanalyse in gist.