Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae

Deze procedure begint met het kweken van de bait-stam in medium met normale aminozuren voor de SLAC-controllestam en zwaar isotopisch lysine en arginine. Gelijke hoeveelheden van beide stammen worden gemengd en gelyseerd door middel van malen en vloeibare stikstof. De ruwe lysaten worden eerst gepelet door centrifugatie en vervolgens gezuiverd door binding aan spheros-beads. Het cellysaat wordt vervolgens gebonden aan IgG-beads.

De eiwitten die gebonden zijn aan de IgG-beads worden door protease geëlueerd, gesplitst en neergeslagen. Het monster is nu klaar voor analyse via massaspectrometrie. Hallo, ik ben Jesse Chao van het Lone Lab in de afdeling Cell Environmental Biology aan het Life Sciences Institute van de University of British Columbia.

Vandaag tonen we u een procedure voor kwantitatieve proteomische analyse genaamd SILAC, gecombineerd met affiniteitszuivering. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om proteïnecomplexen te bestuderen.

Laten we beginnen. In deze procedure bevat de bait-stam normale aminozuren, terwijl de SLAC-controlestam zware isotopische lysine en arginine bevat. Om te beginnen kweekt u eerst van zowel de bait-stam als de controlestam één liter apart tot de waarde die op uw scherm wordt weergegeven. Giet de cultuur vervolgens in Nalgene-centrifugebuizen van 500 milliliter.

Centrifugeer de cellen in pelletcellen bij 2.580 RCF, decanteer het medium en resuspendeer de pellet in 50 milliliters koude D H2O terwijl u de cellen overbrengt naar centrifugebuizen van 50 milliliters. Centrifugeer de buizen om de cellen te pelletteren bij 3000 RCF. Op dit punt kunt u de pellet invriezen bij negatief 80 graden Celsius.

Het is belangrijk om eraan te denken de controlestamcultuur in een verhouding van één-op-één op basis van het droge pelletgewicht af te stemmen op de lokstamcultuur. Resuspendeer elk celpellet in 10 milliliters NP 40-buffer met een protease-remmercocktail in een verhouding van één op 2000. Meng de twee celculturen door de inhoud van de ene buis direct over te gieten in de andere.

Om te beginnen met het vermalen van de cellen, giet u eerst vloeibare stikstof in de vooraf gekoelde vijzel en laat u deze volledig verdampen. Voeg vervolgens twee milliliters cellen toe aan de vijzel. Giet wat vloeibare stikstof bij om de cellen te bevriezen.

Maal de cellen tot ze een fijn poeder vormen. Herhaal dit proces totdat alle cellen zijn gemalen. Zorg ervoor dat de cellen niet ontdooien.

Voeg indien nodig vloeibare stikstof toe. Breng het poeder vervolgens over naar een ijskoud bekerglas en laat het op kamertemperatuur ontdooien. Wanneer de randen beginnen te ontdooien, voegt u 20 milliliters NP 40-buffer met een 1:200 PIC toe nadat het volledig is ontdooid.

Breng het ruwe lysaat over in 40 milliliter Nalgene-buisjes en centrifugeer dit gedurende 30 minuten bij 16, 000 RPM in een Sovos SA 600-rotor. Neem tijdens het wachten 300 microliters van de SROs twee B-beads en was de beads drie keer in 300 microliters NP 40-buffer. Resuspendeer de beads vervolgens in 300 microliters buffer, zodat ze in een slurry van één-op-één zijn.

De volgende stap is het voorzuiveren van het cellysaat. Hiervoor brengt u eerst het supernatant over naar een nieuwe buis en voegt u de Spheros two B beads toe. Incubeer dit gedurende 30 minuten op een roterend platform in een koelruimte.

Neem tijdens het incuberen 300 µL van de IgG SROs six beads en was de beads drie keer in 300 µL NP 40 buffer. Resuspendeer de beads vervolgens in 300 µL buffer zodat ze in een one-to-one slurry zijn. Pellet de SROs na incubatie.

Voeg twee beads toe. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis. Vergeet niet een aliquot van het cellysaat te bewaren voor latere western blotting.

Voeg vervolgens de IgG-beads toe. Verdeel de inhoud over twee buisjes voor een efficiëntere binding en incubeer gedurende twee uur op een roteerplatform in een koude kamer. Verzamel na incubatie de beads in een chromatografiekolom bij 4 °C.

Zorg ervoor dat u een aliquot van de ongebonden fractie bewaart. Was de beads met 10 milliliters NP 40-buffer.

Was de kralen vervolgens met drie milliliter TEVC-buffer. Vergeet niet opnieuw een aliquot van de kralen te bewaren.

Dit zal de efficiëntie van de binding weerspiegelen om de beads te elueren. Voeg eerst vijf µL A-C-T-E-V toe aan één mL TEVC-buffer. Voeg TEVC-buffer toe aan de beads en meng.

Breng de inhoud over naar twee 1,5 milliliter EINOR-buisjes voor een efficiëntere menging en incubeer deze gedurende de nacht op een roteerplatform in een koelkamer. Centrifugeer vervolgens de kraaltjes en breng het eluaat over naar een nieuw 1,5 milliliter buisje. Was de kraaltjes vervolgens met nogmaals 0,5 milliliter TEVC-buffer.

Combineer de acht in één buis. U zou in totaal 1,5 milliliters van ELU acht moeten hebben. Bewaar een aliquot van de TEV Elu acht voor precipitatie.

Pas de aliquots aan naar 25%TCA met honderd procent TCA. Verdeel hiervoor de 1,5 milliliter LU acht over twee buisjes van elk 750 microliters. Voeg 250 microliters 100%TCA toe aan het buisje.

Uw oplossing moet melkachtig worden. Plaats deze vervolgens gedurende 30 minuten op ijs. Vortex het mengsel periodiek na de incubatie.

Centrifuge 30 minuten lang op maximale snelheid in een tafelcentrifuge in een koelruimte. Was één keer met 500 µL ijskoud aceton dat 0,05 normaal zoutzuur bevat. Centrifugeer vervolgens vijf minuten op maximale snelheid bij 4 °C.

Was vervolgens één keer met 500 µL ijskoud aceton en centrifugeer vijf minuten op maximale snelheid bij 4 °C. Verwijder na het centrifugeren voorzichtig het aceton en droog het pellet voor zilverkleuring. Resuspendeer het pellet in 50 µL van een 1× SDS-monsterbuffer.

Als u van plan bent het geprecipiteerde eiwit te gebruiken voor analyse op basis van massaspectrometrie, wordt aanbevolen om ethanol voor de precipitatie te gebruiken. Voeg hiervoor eerst 20 µg glycogeen toe, verdun de monsters vervolgens vijfmaal met 100% ethanol en stel het aan te passen naar 50 mM natriumbicarbonaat met een 2,5 M voorraadoplossing bij pH 5,0. Meng de oplossing door de buis om te keren.

Laat dit twee uur staan bij kamertemperatuur. Verdeel vervolgens de inhoud over twee eppendorfbuisjes. Pelleteer het neergeslagen eiwit door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 12, 000 GS bij kamertemperatuur.

Het tijdens de zuiveringsprocedure bewaarde aliquot moet het vooraf geklaarde cellificaat, de gebonden fractie, de ongebonden fractie en de geëlueerde fractie bevatten. Wij raden aan om de eiwitinhoud van de bovenstaande aliquoten te analyseren via Western blotting met Antit TAP-antilichamen of via zilverkleuring om de bindings- en elutie-efficiëntie van het experiment in kaart te brengen. In deze zilvergekleurde gel werden gezuiverde SCS two tap en de interactiepartners gevisualiseerd en vergeleken met een niet-getagde controle in deze Western blot.

Verschillende fracties die tijdens de zuivering van SCS two tap werden afgenomen, werden geanalyseerd via Western blotting met gebruik van Antit tap-antilichamen. Merk op dat SCS two tap migreerde naar een lager moleculair gewicht na elutie door TEV-proteasesplitsing, en dat er na elutie geen SCS two tap meer achterbleef op de IgG-beads. Dit bevestigde dat de zuivering zeer efficiënt was.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u eiwitcomplexen kunt zuiveren via affiniteitszuivering met IgG-beads. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken dat u de basisstam en de controlestam op basis van het drooggewicht van de pellet gelijkstelt voordat u met de zuiveringsprocedure begint. Aangezien LAC ons onbevooroordeelde en gekwantificeerde metingen van eiwitbindingspartners oplevert, voeren we alleen de eerste fase van de tap-zuivering uit om monsterverlies te minimaliseren.

Als u aanzienlijke hoeveelheden aspecifieke binding ervaart, kunt u overwegen het volledige protocol uit te voeren, dat te vinden is in de cold springing harbor handleiding. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

Hé, kom op, mark. Ah, ga maar.