Identificatie van eiwit complexen in

Het doel van dit experiment is het identificeren van eiwitten, eiwitinteracties en de subeenheidssamenstelling van native MultiPro-complexen uit E. coli. Dit wordt bereikt door het amplificeren van sequentie-specifieke lineaire PCR-producten, die de SPA-tag en een selecteerbare marker coderen, welke in frame worden geïntegreerd en tot expressie gebracht als carboxy-terminale fusies in een ddy 3, 3 0-achtergrond met behulp van het bacteriële faag lambda recombinatiesysteem; als tweede stap wordt een duale zuiveringsstap uitgevoerd met behulp van cow modlin en Anti-Flag affiniteitsbeads om eiwitcomplexen met een lage abundantie efficiënt terug te winnen. Vervolgens worden de gebonden eiwitten, geëlueerd met cow modlin, elutiebuffer of CEB, gedigesteerd met trypsine en verwerkt met massaspectrometrie voor eiwitidentificatie.

De verkregen resultaten tonen aan dat de diverse subeenheden van het kern-RNA-polymerase-enzym, inclusief de transcriptieterminatie- en anti-terminatiefactoren, efficiënt werden meegezuiverd met het getagde RNA-polymerase subeenheid D-eiwit, wat aangeeft dat nieuw geassocieerde componenten met deze aanpak efficiënt kunnen worden ontsloten. Over het algemeen kunnen personen die niet bekend zijn met deze methode moeite hebben met tweerounds affiniteitszuiveringen, waarbij zorgvuldige verwerking van de cellysaten met geschikte buffersolutions absoluut noodzakelijk is om succesvolle en efficiënte terugwinning van complexen met zowel lage als hoge abundantie uit grootschalige culturen te garanderen. De affiniteitszuivering- en massaspectrometrieprocedures zullen worden gedemonstreerd door Olga Kagan en HBO guo, twee technici in mijn laboratorium. Dit protocol begint met het targeten van specifieke geamplificeerde sequenties in de DDY three 30-stam, waarin de Lambda red recombinatiemachinerie tot expressie komt, zoals beschreven in het geschreven protocol.

Kweek vervolgens de bacteriële stam die het fage Lambda-recombinatiesysteem tot expressie brengt gedurende de nacht in twee milliliters Luria-Bertani of LB-medium bij 32 °C, schudden bij 180 RPM. Inoculeer de volgende dag één milliliter van de nachtcultuur in 70 milliliters vers LB-medium in een conische kolf van 500 milliliters. Kweek het inoculum bij 32 °C door te schudden bij 180 RPM tot de OD 600 ongeveer 0,8 bereikt. Induceer de cellen door de kolf 15 minuten in een waterbad bij 42 °C te incuberen onder voorzichtig schudden bij 180 RPM.

Incubeer de kolf direct na de inductie gedurende ten minste 30 minuten met schudden in een ijs-waterbad. Nadat de cellen zijn geoogst en gewassen zoals beschreven in de schriftelijke procedure, wordt de celpellet resuspendeerd in 700 µL ijskoud, steriel water, wat resulteert in elektrocompetente cellen via elektroporatie. Voeg één µL van het gezuiverde amplicon toe aan 40 µL van de elektrocompetente cellen.

De cellen worden geëlektroporeerd na homologe recombinatie en integratie. De transformanten die de tag-cassette succesvol in het chromosoom hebben gerecombineerd, worden geselecteerd op basis van resistentie tegen kanamycine. Selecteer meerdere transformanten voor western blotting om de correcte generatie van de SPA-tagged fusie-eiwitten te verifiëren met een Anti-Flag M2-antilichaam dat selectief is voor de flag-epitopen van de SPA-tag. Breng 10 ml van de overnight-cultuur over in 990 ml vers TB, aangevuld met 25 µg/ml kanamycine, in een fles van 4 liter.

Kweek de cultuur bij 32 °C met constant schudden op 250 RPM gedurende vijf tot zes uur, totdat de OD 600 een waarde tussen twee en drie bereikt. Draag de ene liter e coli SPA tag-cultuur over naar schone centrifugebuizen en centrifugeer de cellen bij 4 °C en 3.993 ×g gedurende 15 minuten. Resuspendeer de cellen vervolgens zoals beschreven in het schriftelijke protocol.

Breng de monsters over naar een steriele roestvrijstalen beker die op ijs is geplaatst voor sonicatie. Dompel de probe in het monster en soniceer gedurende drie minuten. Laat het monster na de sonicatie nog twee minuten afkoelen om oververhitting te voorkomen, gevolgd door centrifugatie van het gesoniceerde lysaat.

Breng het S-supernatans voorzichtig over van de centrifugebuis naar een polypropyleen Falcon-buis van 50 milliliter. Vries het monster in met vloeibare stikstof en bewaar het gesoniceerde bevroren cel-extract voor toekomstig gebruik gedurende maximaal zes maanden bij minus 80 °C. Om de affiniteitszuivering van het bevroren gesoniceerde cel-extract te starten, plaatst u de buis in koud water en incubeert u het TH-cel-extract met drie µL benzo, een nuclease, gedurende 30 minuten bij 4 °C.

Voeg aan dit mengsel het niet-ionische detergent Triton X 100 en 200 µL suspensies van Anti-Flag M2 agro beads toe. Meng de inhoud voorzichtig door de buis drie uur lang te roteren bij 4 °C. Centrifugeer de buis na drie uur roteren bij 1.700 ×g gedurende zes minuten. Verwijder na centrifugatie voorzichtig zoveel mogelijk van de supernatant zonder de losse pellet te verstoren.

Resuspendeer het pellet in het resterende SNA en breng dit vervolgens over in een polypropyleen prep-kolom. Verwijder de onderste uitlaatpluggen van de kolom zodat het eluaat door zwaartekracht kan weglopen. Was de kolom vervolgens vijf keer met 200 µL van een 1× FC-buffer en ga over tot elutie met TEV zoals beschreven in het geschreven protocol.

Na de splitsing moet de kolom zowel aan de boven- als onderzijde strak worden afgesloten. Meng de inhoud van de kolom voorzichtig door deze gedurende de nacht bij vier graden Celsius te roteren. Laat het eluaat na de nachtelijke rotatie door de bovenkap en de bodemplug te verwijderen in een nieuwe kolom lopen.

Was de oude kolom met 400 µL 1x Cal Modlin bindingsbuffer en 150 µL suspensie van Cal Modlin bindingsbeads. Elueer het gebonden eiwit in vier fracties van 50 µL in een schone eend orph tube, gebruikmakend van 1x Cal Modlin elutiebuffer.

Verdeel de geëlueerde fractie in gelijke volumes over twee schone Eppendorf-buisjes. Droog vervolgens de inhoud van beide buisjes met een vacuumsysteem. Het gedroogde eluaat uit één buisje wordt gebruikt voor het draaien van een zilverkleuringsgel zoals beschreven in de tekst, terwijl het andere wordt bewaard bij -80 °C.

Voor toekomstig gebruik in massaspectrometrie voegt u aan het gedroogde monster 50 µL van de digestiebuffer en 0,9 µL van 100 mM tris-fosfinezoutzuur toe. Incubeer het mengsel gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur voor de reductiestap. Voeg vervolgens 1 µL van 500 mM IDO-acetamide toe en incubeer dit gedurende nog eens 40 minuten in het donker om alkylering van het monster mogelijk te maken. Voeg na de tweede incubatieronde 1 µg trypsine toe aan het mengsel. Incubeer het monster na deze incubatie ofwel vijf uur bij 37 °C of overnacht bij kamertemperatuur.

Zorg ervoor dat de reactie wordt gestopt door één µL azijnzuur toe te voegen. Bereid vervolgens de Millipore zip tip pipetteertip voor zoals beschreven in de tekst voor een efficiënte binding van het peptide aan de tip. Meng het peptidemengsel 20 keer en was het peptidemengsel dat aan de tip is gebonden weg door de wasoplossing op te zuigen en weer te dispenseren.

Herhaal deze procedure twee keer voor een efficiënte binding van het peptidemengsel aan de tip, waarbij de tip het gebonden peptide bevat. Aspireer 10 µL van de bevochtigings- en equilibratieveftuuning en dispenseer dit in een schone Eppendorf-buis. Herhaal deze stap twee keer.

Nadat de geëlueerde monsters in een speedvacuüm zijn gedroogd, kunnen de monsters onmiddellijk via massaspectrometrie worden geanalyseerd of vóór gebruik worden bewaard bij min 80 graden Celsius. De microkolommen die in deze procedure worden gebruikt, zijn gevuld met ongeveer 10 centimeter drie micron Lunar C18-hars en zijn gekoppeld aan een Pro Zion nano-electrospray-ionenbron die in lijn met het Orbitrap-instrument is geplaatst. Een Pro Zion nano-flow binaire HPLC-pomp wordt gebruikt om tijdens de peptide-scheidingen een stabiele tip-stroomsnelheid van ongeveer 300 nanoliter per minuut te leveren om peptideverdunning te bereiken; stel een organische buffergradiënt in op basis van de complexiteit van het monster.

Voor dit e coli SPA-monster bevat de mobiele fase oplosmiddel A 95% HPLC-gradlewater en 5% acetonitril met 0,1% mierenzuur, terwijl oplosmiddel B bestaat uit 5% HPLC-gradlewater en 95% acetonitril met 0,1% mierenzuur. Na de massaspectrometrie worden de spectra doorzocht met een database-zoekalgoritme, zoals SeaQuest, tegen een database van e coli eiwitsequenties. Filter de resultaten statistisch met een waarschijnlijkheidsalgoritme, zoals StarQuest, om een lage false discovery rate te garanderen. Zowel het SPA-getagde RNA-polymerase sigma-factor als het Yak L-eiwit van onbekende functie co-purificeerden specifiek met het kern-RNA-polymerase-enzym, inclusief de alfa-, bèta- en bèta-prime-subunits, alsook de RNA-polymerase recyclingfactor. In tegenstelling tot de getagde RNA-polymerase sigma-factor bond Yak L zich bovendien aan een essentiële transcriptieterminatie anti-determinatiefactor, wat wijst op een gespecialiseerde functie in de transcriptie.

Verschillende andere kleinere co-zuiverende eiwitten werden ook gedetecteerd via LCMS die niet zichtbaar waren op de gel, waaronder de Omega-subunit van RNA-polymerase, transcriptie-terminatie- en determinatiefactoren, en USA en NUSD. Omgekeerd co-zuiverden in een onafhankelijk experiment getagde componenten van het zwavelmobilisatiemechanisme, S-U-F-B-S-U-F-C en SUFD, met elkaar, wat wijst op een gezamenlijke deelname aan de biosynthese van ijzer-zwavelclusters als een enkel steigercomplex. Dit representatieve voorbeeld benadrukt het feit dat eerder goed bestudeerde, uitgebreid geannoteerde bacteriële MultiPro-complexen die deelnemen aan essentiële biologische processen vaak nieuwe geassocieerde componenten hebben die efficiënt geïdentificeerd kunnen worden.

Bij het gebruik van deze aanpak kan het lage kopiegetal van het SUFB-eiwit hebben geleid tot een zwakke signaalintensiteit in vergelijking met de sterke intensiteit die waargenomen werd bij de pull-down experimenten van SUFC en SUFD. Om de samenstelling van stabiele multi-unit eiwitcomplexen te definiëren, werden copurificatiescores toegekend aan interacties met een hoge betrouwbaarheid, waarbij rekening werd gehouden met de uniciteit van bait-prey, bait-bait en prey-prey relaties. Vervolgens werden, met behulp van grafiekclusteringprocedures zoals het Markov-clusteringalgoritme, discrete eiwitclusters geïdentificeerd uit het gepartitioneerde probabilistische PPI-netwerk.

Vermoede interactienetwerken kunnen worden gevisualiseerd met behulp van Cytoscape. Het combineren van proteomomicsgegevens met aanvullende bewijzen voor functionele associatie, afgeleid uit genomische methoden, kan worden gebruikt om nieuwe mechanistische rollen van eerder geannoteerde e coli-eiwitten te onderzoeken. Hier zijn subnetwerken van eiwitcomplexen en functionele modules die deelnemen als bredere functionele buurtschappen gedefinieerd in e coli.

De hoofdhiërarchische cluster Graham toont de patronen van functionele voorspellingen en bestaande annotaties voor de functioneel wees en gekenmerkte genen van E. coli; geel en blauw representeren respectievelijk bestaande en afgeleide functies, terwijl de kleurintensiteit de betrouwbaarheidsscores weerspiegelt. Biologische processen die geassocieerd zijn met verschillende buurten zijn rechts aangegeven; de insets tonen de individuele componenten van een representatieve buurt op basis van de geïntegreerde fysieke en functionele interactienetwerksimilariteitsscores. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe stabiele proteïnecomplexen uit E. coli geïsoleerd kunnen worden met behulp van de methode van affiniteitszuivering gekoppeld aan massaspectrometrie.

In principe kan deze techniek worden toegepast om membraaneiwitcomplexen of eiwitcomplexen van elke andere soort te karakteriseren, mits recombinante productie mogelijk is.