Gestandaardiseerde Voorbereiding van de Single-celsuspensies van Mouse longweefsel met behulp van de gentleMACS Dissociator
2 juli 2009
Dissociëren cellen van specifiek weefsel soorten vereist specifieke parameters voor weefsel opwinding tot het verkrijgen van een hoog volume van levensvatbare, kweekbare cellen. De Miltenyi gentleMACS dissociator optimaliseert deze taak met een eenvoudige, praktische protocol. In deze publicatie het gebruik van dit apparaat op longweefsel wordt uitgelegd.
In dit videoprotocol leert u hoe u adult muislongweefsel kunt dissociëren met gentle max na de dissociatie van het longweefsel. In aanwezigheid van collagenase d en DNase I worden cel-suspensies gefiltreerd met een 70 micron cell strainer, gecentrifugeerd en gesuspendeerd voor verdere toepassingen. Hallo, ik ben Melanie Mlu van Mil Biotech in Duitsland.
Vandaag laat ik u een reproduceerbare en geautomatiseerde procedure zien voor het bereiden van een single-cell suspensie uit longweefsel van muizen met behulp van de GenX-dissociatie. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om single-cell suspensies voor te bereiden voor de isolatie van leukocyten of endotheelcellen. Laten we beginnen.
Voordat we met het protocol beginnen, moeten enkele standaardoplossingen worden bereid en klaargezet. Ten eerste hebben we Hebes-buffer nodig. Ten tweede een collagenase D-oplossing die 100 mg/mL enzym en Hebes-buffer bevat.
Ten derde, een dase one-oplossing met 20.000 units per milliliter dase one. Ten slotte, twee gangbare bufferoplossingen: een typische PBS-buffer bij pH 7,2 en een PEB-buffer afgeleid van AutoMax-spoelmiddel en een BSA-stockoplossing.
We beginnen ons protocol met een gedissecteerde long afkomstig van een vrouwelijke biopsiemuis van zes tot zeven weken oud. Zorg ervoor dat de long vrij is van aangrenzende organen zoals het hart en de thymus, efferente en afferente bloedvaten, de trachea en bindweefsels. Spoel het weefsel in een Petrischaal met PBS om erytrocyten te verwijderen.
Een muizenlong weegt op deze leeftijd doorgaans tussen de 110 en 150 milligram. Als u van plan bent longen van oudere dieren of andere muizenstammen te dissociëren, weeg dan het weefsel en de buffer. Per buis kan maximaal 450 milligram weefsel worden gedissocieerd.
Breng het longweefsel over naar een gentle max C-buis die is gevuld met 4,9 milliliters Heis-buffer. Voeg 100 microliters collagenase D-oplossing toe aan het longweefsel en de buffer voor een eindconcentratie van twee milligram per milliliter. Voeg nu 10 microliters dase toe.
Eén oplossing voor meer dan 150 milligram weefsel. Voeg 20 µL dase one solution toe. Zorg ervoor dat de C-buis stevig gesloten is en plaats deze ondersteboven op de gentle max dis.
Zorg ervoor dat het weefsel zich tussen de rotor en de stator bevindt. Selecteer het longprogramma en start dit door op de startknop te drukken wanneer het programma is beëindigd. Verwijder de C-buis uit het instrument en incubeer het monster gedurende 30 minuten.
Tijdens de incubatie in een incubator van 37 °C moet de buis worden geroteerd met een max mix buisrotator of elke vijf minuten handmatig worden gedraaid. Plaats na de incubatie de C-buis terug in de gentle max Associator en start het tweede longprogramma. Terwijl het programma draait, bereidt u een buis van 50 mL voor om de gefiltreerde cellen op te vangen door de dop te vervangen door een cellzeef met een maaswijdte van 70 µm. Zodra het dissociatieprogramma is beëindigd, kunt u de buis afhankelijk van de verdeling van het monstermateriaal in de buis kort centrigeren om het monstermateriaal te concentreren.
De gedissocieerde cellen kunnen uit de buis worden verwijderd door te pipetteren via de met een septum verzegelde dop van de C-buis. Met een geschikte pipetpunt van 1000 µL wordt de celsuspensie op de celzeef aangebracht om grotere partikels of aggregaten te verwijderen. Zodra de oplossing is weggevloeid, wordt de celzeef gewassen door vijf milliliter HBES-buffer op kamertemperatuur toe te voegen om de gefilterde cellen te pelletteren.
Centrifugeer de koker van 50 milliliter bij 300 GS gedurende 10 minuten. Aspireer nu het supernatant en resuspendeer de celpellet in het gewenste volume PEB-buffer op kamertemperatuur.
Giet het supernatant niet af. U kunt nu doorgaan met uw downstream-applicatie. Dissociatie van longweefsel van muizen met behulp van deze procedure levert een hoog percentage levensvatbare leukocyten en endotheelcellen op.
De verkregen enkelcel-suspensies werden gekleurd met CD 45 PE, CD 1 46 FITC of CD 31 FITC en geanalyseerd via flowcytometrie. Deze plot laat de verrijking van dendritische cellen zien met behulp van CD 11 C microbeads, een minimax-separator en twee MS-kolommen. Ik heb u zojuist laten zien hoe u op een gestandaardiseerde manier enkelcel-suspensies bereidt uit longweefsel van muizen door gebruik te maken van de gentle mix-dissociatie en C-buizen.
Deze methode maakt een efficiënte dissociatie van longweefsel mogelijk. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de long zorgvuldig te dissekeren en het weefsel onmiddellijk na dissectie te verwerken. De geprepareerde single-cell suspensies kunnen vervolgens worden gebruikt voor verdere experimenten.
Bijvoorbeeld de magnetische markering van de cellen, gevolgd door de scheiding van leukocyten of endotheelcellen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit videoprotocol demonstreert de dissociatie van longweefsel van volwassen muizen met behulp van de gentleMACS dissociator. De procedure is ontworpen om een groot volume levensvatbare, kweekbare cellen te produceren voor verdere toepassingen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Cel-dissociatietechnieken
- Bereiding van een single-cell suspensie
- Analyse van longweefsel van muizen
Achtergrond
- Het dissocieren van cellen uit weefsels vereist specifieke parameters.
- De gentleMACS dissociator biedt een geoptimaliseerd protocol.
- Collagenase D en DNase worden gebruikt in het dissociatieproces.
- Gefilterde cel-suspensies worden klaargemaakt voor verdere toepassingen.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbare methode aan te tonen voor het bereiden van enkelcel-suspensies.
- Om de studie naar leukocyten en endotheelcellen te faciliteren.
- Om een praktisch protocol te bieden voor onderzoekers in het vakgebied.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een gentleMACS-dissociator voor weefselagitatie.
- Toepassing van collagenase D en DNase tijdens de dissociatie.
- Filtratie van cel-suspensies door een celzeef van 70 micron.
- Centrifugatie en suspensie van cellen voor verdere toepassingen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle dissociatie van longweefsel van muizen tot enkelcel-suspensies.
- Hoge opbrengst aan levensvatbare, kweekbare cellen.
- Protocol demonstreerde reproduceerbaarheid en efficiëntie.
- Preparatie geschikt voor downstream toepassingen.
Conclusies
- De gentleMACS-dissociator is effectief voor de dissociatie van longweefsel.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende weefseltypen.
- Biedt een waardevolle tool voor onderzoekers die longweefsel bestuderen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Gestandaardiseerde weefseldissociatie is een cruciale eerste stap in onderzoek naar immunologie en vasculaire biologie, waardoor reproduceerbare bereiding van primaire celsuspensies voor downstream-analyse mogelijk wordt. De gentleMACS Dissociator biedt een geautomatiseerde, zachte en schaalbare methode voor het genereren van single-cell suspensies met een hoge levensvatbaarheid uit longweefsel van muizen, wat zorgt voor een consistente input voor flowcytometrie, celsortering en moleculaire profilering. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellend vertrouwen in target-validatiestudies door de variabiliteit in cellulaire opbrengst en levensvatbaarheid tussen experimenten te verminderen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om leukocyten- en endotheelcelpopulaties in longweefsel te onderzoeken voor het testen van doelgerichte hypothesen.
- Operationele waarde: Vermindert handmatige variabiliteit bij de weefselverwerking, waardoor de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en tijdstippen wordt verbeterd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt een consistente cellulaire input voor flowcytometrie en sortering, wat het vertrouwen in de resultaten van fenotypische screening verhoogt.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert gefilterde, debrisvrije suspensies die geschikt zijn voor antilichaamkleuring en flow-gebaseerde assays.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde enzymatische digestie en mechanische dissociatie waarborgen de consistentie van de celopbrengst tussen verschillende batches.
- Assay-gereedheid: Genereert suspensies die compatibel zijn met downstream-applicaties zoals magnetische labeling en celseparatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Biedt een ziekterelateerd systeem voor het bestuderen van immuun- en vaatceldynamiek in longweefsel.
- Ondersteuning van preklinische modellen: Maakt de isolatie van primaire cellen uit muizenlongen mogelijk voor mechanistische risicoreductie van therapeutische doelwitten.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Betrouwbare celpreparatie ondersteunt consistente biomarkeranalyse en functionele validatie in preklinische workflows.
Integratie van Pipeline & Workflow
De gentleMACS Dissociator past in de discovery-workflow als een gestandaardiseerde stap voor monstervoorbereiding tussen het oogsten van weefsel en de cellulaire analyse, waardoor een betrouwbare overgang van ex vivo weefsel naar analyseklare enkelcellen mogelijk wordt gemaakt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-gestuurde isolatie van immuun- en stromale cellen in de longen voor pad-analyse.
- Screening: Levert reproduceerbare cel-suspensies voor high-content of flow-gebaseerde fenotypische screening van immuunmodulatoren.
- Analytica: Maakt kwantitatieve flowcytometrie-uitlezingen mogelijk (bijv. CD45+, CD31+) voor het vergelijken van experimentele condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt murine longmodellen met mens-relevante immuun- en endotheelcelstudies via gestandaardiseerde preparatie.
- Hergebruik binnen de organisatie: Het voorgeprogrammeerde longprotocol van het instrument maakt hergebruik mogelijk in projecten die pulmonale ontsteking, fibrose of infectie bestuderen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Een hoge levensvatbaarheid en zuiverheid van leukocyten en endotheelcellen verhogen de datakwaliteit in downstream-applicaties.
- Operationele waarde: Automatisering vermindert de hands-on tijd en de gebruikersafhankelijke variabiliteit bij weefseldissociatie.
- Strategische waarde: Maakt go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van consistente cellulaire opbrengsten en metrics voor levensvatbaarheid.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van targets door betrouwbare primaire cel-inputs voor validatie te leveren.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist training in aseptische weefseldissectie en enzymatische behandeling.
- Afhankelijk van toegang tot een gentleMACS Dissociator met een longspecifiek programma en C-buizen.
- Vereist standaardisatie van enzymconcentraties (Collagenase D, DNase) en buffercondities tussen verschillende gebruikers.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende muisstammen, leeftijden of ziektebeelden die de weefseldichtheid beïnvloeden.
- Beperkt tot weefsels die compatibel zijn met enzymatische dissociatie; mechanische alternatieven kunnen nodig zijn voor fibreuze of verkalkte monsters.
