Isolatie & Karakterisering van Hoechst ^Lage CD45 ^Negatief Muis Lung Mesenchymale stamcellen

Deze video demonstreert een protocol voor de isolatie van gastheer lage CD 45 negatieve longmesenchymale stamcellen. Weefselresonante mesenchymale stamcellen of MSC's zijn belangrijke regulatoren van weefselherstel of regeneratie, fibrose, ontsteking en angiogenese. Eerst worden de longen gedisseceerd uit een geofferde muis.

Het longweefsel wordt gedigesteerd om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen. De cellen worden gekleurd met hoax-kleurstof en CD 45 en vervolgens gesorteerd via flowcytometrie om gastheer-lage CD 45-negatieve long-MSC's te verkrijgen. De long-MSC's worden vervolgens in cultuur uitgebreid en er wordt een colony-forming assay uitgevoerd om de differentiatiecapaciteiten van de MSC's te beoordelen.

Vervolgstudies kunnen vervolgens worden uitgevoerd om de rol van MSC's tijdens weefselhomeostase en ziekte te onderzoeken. De methode die we hier tonen, kan worden gebruikt om zowel muis- als menselijke longmesenchymale stamcellen te isoleren en kan worden toegepast op de studie naar longziekten zoals longfibrose, pulmonale hypertensie en COPD. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ervaren vanwege de variëteit aan beschikbare methoden voor weefselvoorbereiding, evenals de instelling van de flowcytometer, de passende controles en de analyse.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het lastig is om de juiste techniek voor het fijnmalen en verteren van het longweefsel voor een optimale celviabiliteit uitsluitend met woorden te beschrijven. Daarnaast worden de configuratie van het flowcytometrie-instrument en de analyses het beste via een demonstratie overgebracht. Begin dit protocol door de longen te verwijderen van een geofferde volwassen muis, die gebruikt zullen worden om mesenchymale stamcellen te verkrijgen.

Gebruik een klein schaartje met scherpe punten om de ribbenkast van de muis aan weerszijden lateraal door te knippen. Open de borstholte en verwijder vervolgens het diafragma. Steek een spuit van 10 milliliter met een naald van 20,5 gauge in de rechterhartventrikel en druk voorzichtig de zuiger in om deze te perfunderen met 3 tot 5 milliliter PBS, zodat het bloed uit de longen wordt gespoeld.

Knip vervolgens met een schaar de trachea en de grote bronchus af en gooi deze weg. Pak daarna met een pincet de kleine witte longkwabben op en plaats deze in een Petrischaal gevuld met Hank's gebufferde zoutoplossing of HBSS.

Verwijder vervolgens het hart en scheid de longkwabben. Herhaal dit proces voor alle muizen in de studie. Breng de longkwabben over naar het deksel van de schaal.

Bevocht het weefsel met net genoeg HBSS om uitdroging te voorkomen. Hak vervolgens met een wegwerpscalpel de longkwabben fijn om beenmerg te verkrijgen voor gebruik als positieve controle voor flowcytometrie. Gebruik een scherp schaartje om door te knippen bij de enkel en de bovenkant van het dijbeen.

Plaats het ledemaat in een nieuwe Petrischaal. Snijd vervolgens de knie af, zodat er een lineair stuk dijbeen (femur) overblijft en een tweede stuk met het scheenbeen (tibia) en kuitbeen (fibula). Verwijder met een pincet het spierweefsel om het scheenbeen, kuitbeen en dijbeen bloot te leggen.

Neem nu een spuit van 5 mL met een naald van 26,5 gauge en steek de naald in de opening van het beenmerg. Houd het bot vast bij één uiteinde van de tibia, met het andere uiteinde gericht in een conische buis van 50 mL gevuld met 15 mL HBSS, en druk op de zuiger om HBSS te dispenseren en het beenmerg in de buis te spoelen. Herhaal dit proces met een fibula en femur.

Kleur het beenmerg met host 3 3 3 4 2 kleurstof bij een eindconcentratie van 5 µg/mL in aangevuld high glucose DMEM. Vervolgens wordt een enkelcel-suspensie van longweefsel gegenereerd uit het geïsoleerde weefsel. Plaats elke long in een buis met voorverwarmde 0,2% Worthington.

Bereid type twee collagenase voor in steriel HBSS, dompel de buis vervolgens onder in een waterbad van 37 °C en incubeer gedurende 30 minuten. Gebruik na de incubatie de 10 ml pipet om het monster te tritureren totdat het digestaat gemakkelijk door de pipet stroomt. Voer dit ongeveer 10 keer uit en incubeer vervolgens nog eens 15 minuten bij 37 °C om de weefseldigestie te voltooien.

Zodra de digestie is voltooid, wordt de celsuspensie verdund met HBSS en wordt een pipet van vijf milliliter gebruikt om eventuele resterende weefselfragmenten opnieuw te dispergeren. Giet vervolgens de suspensie door een 70 micromolar cell strainer in een conische buis van 50 milliliter om onverteerde weefselfragmenten te verwijderen. Voeg de suspensie geleidelijk toe zodat het monster door de cell strainer kan vloeien.

Indien onverteerde weefselfragmenten de stroom van de celsuspensie volledig blokkeren: giet de suspensie door een nieuwe celzeef in een nieuwe buis. Pelleteer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 450 RCF.

Decanteer na het centrifugeren het supernatant en resuspendeer het celpellet voorzichtig in lysisbuffer voor rode bloedcellen op kamertemperatuur; incubeer dit vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens een gelijk volume HBSS toe om de lysisbuffer te inactiveren.

Giet de celsuspensie door een celzeef van 40 µm om debris en celaggregaten te verwijderen, en verzamel het filtraat in een nieuwe conische buis van 50 ml. Bepaal vervolgens met een hemocytometer het aantal cellen voor zowel de long- als de beenmergmonsters. Noteer de concentratie en het totale volume van de celsuspensie.

Pelleteer vervolgens de suspensie van enkelvoudige longcellen door centrifugatie bij 450 RCF gedurende 10 minuten. Om de cellen in stand te houden, resuspendeert u zowel de long- als de beenmergcellen tegelijkertijd op 10⁶ cellen per milliliter in voorverwarmd, gesupplementeerd high-glucose DMEM.

Om het DNA te kleuren, wordt HOAXED 3 3 3 4 2 kleurstof toegevoegd tot een eindconcentratie van 5 µg/L. Meng vervolgens de cellen door voorzichtig te keren en incubeer ze gedurende precies 90 minuten in een waterbad van 37 °C. Centrifugeer daarna 10 minuten bij 450 ×g en bewaar de monsters na de spin bij 4 °C.

Ga verder met het kleuren van het long- en beenmergweefsel met anti CD 45 en propidiumjodide ter voorbereiding op analyse via flowcytometrie. Zodra de cellen zijn gekleurd, bewaart u de buisjes op ijs en beschermd tegen licht tot de flowcytometrie-analyse wordt uitgevoerd. Bereid de flowcytometrie voor door te controleren of de lasers van de instrumenten zijn uitgelijnd en of het apparaat is ingesteld voor cel-sortering.

Het gebruikte instrument moet zijn uitgerust met blauwe 488 nanometer, rode 635 nanometer en UV 350 tot 355 nanometer lasers, met twee detectoren op het UV-laserpad met blauwe 45 over 65 en rode 6 75 over 50 filters. Daarnaast moet de UV-rode detector een hoge gevoeligheid hebben voor het rode signaal en moet het instrument zijn uitgerust met een koelunit om de monsters op 10 °C te houden. Stel in de software van het instrument histogramplots in om lineaire forward scatter versus side scatter weer te geven, en een plot voor dubletdiscriminatie die geschikt is voor het instrument.

Een histogramplot van PI met een log-signaal, een rood-versus-blauw-plot met lineaire signalen en een histogramplot van CD 45 A PC met een log-signaal. Zodra het instrument gereed is, plaatst u het gekleurde beenmergmonster in de laadpoort van het instrument. Dit monster wordt gebruikt als controle voor de kleuring en de instelling van het instrument.

Begin met het verzamelen van events en pas de lineaire signalen voor forward scatter en side scatter aan. Om de celpopulatie duidelijk te visualiseren, moeten de cellen zich ongeveer in het onderste centrum van de plot bevinden, met forward scatter op de x-as. Aangezien de nucleaire kleuring PI membraanimpermeabel is, zal deze worden uitgesloten van levende cellen.

Teken een gate-regio rond de PI-positieve dode cellen in het PI-histogram. Instrueer de software van het instrument om de dode cellen in deze gate rood te kleuren.

Het is nuttig om de gekleurde, geventileerde dode cellen als navigatiepunt te gebruiken om de G0/G1-populatie van de gastheer te identificeren. De PI-kleuring wordt eveneens geëxciteerd door de UV-laser en de meeste dode cellen zouden buiten de schaal moeten vallen. Aan de rechterkant van de plot met rode versus blauwe fluorescentie van de gastheer moet de G0/G1-populatie van het beenmerg zichtbaar zijn als een dicht cluster van events.

Stel de detectorspanningen zo in dat de G nul G één cluster rechtsboven het midden van het diagram wordt geplaatst. Een deel van de S-fase en de volledige G twee van de celcyclus kunnen buiten de schaal vallen. Rechtsboven in het rode versus blauwe hoaxed-diagram zal de side population met een lage fluorescentie zichtbaar zijn als een staart die vanaf de linkerkant van de G nul G één cluster naar de linkerbenedenhoek van het diagram loopt.

Teken nu een gate rond de celcluster in de FSC versus SSC. Plot de singlets-populatie die is geïdentificeerd in de doublet-plot en de levende cellen in het PI-histogram. Wijs vervolgens de hoax-plot toe om alleen deze gegate populaties weer te geven.

Teken na het gatten van de host-plot een regio rond de side population. Wijs deze regio toe als een gate voor het CD 45 A PC-histogram, samen met de gates voor light scatter singlets en levende cellen. Nu het systeem is ingesteld, verwijdert u het monster uit de laadpoort en plaatst u het longmonster in de laadpoort.

De instrumentinstellingen hoeven voor dit monster niet opnieuw te worden aangepast. Begin met het verzamelen van events op de rood versus blauw hoax-plot. De G zero G one-cluster voor het longmonster is meestal meer verlengd in de richting van de x-as en vertoont een gelijkenis met het tilde-symbool op een toetsenbord.

De gate voor de side population laag moet in een soortgelijke positie staan als die voor het beenmergmonster. Kleine aanpassingen naar boven of beneden kunnen nodig zijn om een scherpe resolutie van de side population te waarborgen. Handhaaf een laag drukverschil tijdens het sorteren door ervoor te zorgen dat de monsterstroomklep niet te ver wordt geopend.

Om MSC's te isoleren, plaatst u een verzamelplaat met 96 wells in de sorteerkamer en stelt u de sort gates in op het CD 45 A PC-histogram om de positieve en negatieve populaties te scheiden. Verzamel tot slot de cellen, óf als een gemengde populatie in een buis, óf als enkele cellen in een 96-well plaat om klonen te isoleren. Na het verzamelen van de long-MSC's via cell sorting worden de cellen geplaatst in schalen van 30 millimeter met A MEM aangevuld met 20% FBS. In eerste instantie verschijnen de gesorteerde cellen na ongeveer twee tot drie weken als kleine, ronde en heldere cellen.

Kolonies met het mesenchymale fenotype worden zichtbaar en de proliferatie is duidelijker voor elke celpreparatie. Evalueer het vermogen van long-MSC om te differentiëren naar traditionele mesenchymale lijnen van osteoblasten, adipocyten en chondrocyten, evenals hun celoppervlakexpressie van geaccepteerde mesenchymale markers. Voer een cytogenetische banderingsanalyse uit om de afwezigheid van grove chromosomale abnormaliteiten te bevestigen.

Na isolatie door middel van flowcytometrie en het genereren van enkelcelklonen wordt een colony-forming assay uitgevoerd om de MSC-cellen en hun differentiatievermogen te karakteriseren. Begin met cellen verdund tot 3 × 10⁴ cellen per milliliter. In onvolledig cultuurmedium in 100 millimeter schaaltjes wordt een seriële verdunning uitgevoerd van 2,6 × 10⁴, 3 × 10⁴, 1,5 × 10⁴ en 0,75 × 10⁴ cellen per schaaltje in 10 milliliter medium, uitgevoerd in triplikaat.

Plaats de platen na 10 dagen cultuur in de incubator, giet het medium af en spoel de cellen met PBS. Fixeer ze vervolgens door 100% methanol toe te voegen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Giet na vijf minuten de methanol af.

Voeg vervolgens 0,4% gewicht/volume gza, één op 20 verdund met geïoniseerd water, toe om kolonievorming te detecteren en incubeer dit gedurende 10 tot 15 minuten. Giet daarna de kleurstof af en spoel met geïoniseerd water. Laat de monsters aan de lucht drogen en kwantificeer het aantal kolonies met meer dan 25 cellen per kolonie met behulp van een omgekeerde microscoop of visualisatie.

Kolonies zijn groot en bestaan uit enkele honderden cellen, zoals hier getoond, en vertonen een mesenchymaal fenotype. MSC's werden geïsoleerd zoals getoond in deze video en uitgeplaat in 96-wellplaten voor gesimuleerde groei. Gecumuleerde, met CFSE gelabelde antigeen-presenterende cellen werden vervolgens toegevoegd aan de long-MSC's.

De proliferatie van geïsoleerde MSC's werd vervolgens gemeten als de afname in de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van CFSE ten opzichte van de achtergrond, bestaande uit enkel CFSE-gelabelde T-cellen zoals in deze figuur wordt getoond, in afwezigheid van long-SC en aanwezigheid van antigeenpresenterende cellen; APC plus minus OVA CD 40-positieve geactiveerde T-cellen vertonen een afname in CFSE-intensiteit, wat duidt op proliferatie (rood omcirkeld). De CFSE-fluorescentie-intensiteit van het T-celmembraan neemt exponentieel af bij elke celdeling, oftewel met de helft per deling; in aanwezigheid van long-MSC-APC plus minus OVA CD 40-positieve geactiveerde T-cellen is er geen significante verandering in CFSE-intensiteit waarneembaar, wat duidt op een gebrek aan proliferatie. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de longstamcelbiologie om de rol van mesenchymale stamcellen bij longziekten, zoals pulmonale arteriële hypertensie en longfibrose, te onderzoeken.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer vijf uur worden uitgevoerd volgens deze procedure. Andere methoden, zoals differentiatie-assays, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, waaronder of de vermeende longmesenchymale stamcellen een geschikte multiliniage-differentiatie vertonen, met potentieel voor bot, vet en kraakbeen.