Een high-throughput-methode voor zebravis sperma cryopreservatie en In Vitro Bevruchting

Hallo, ik ben Bruce Draper van de University of California Davis, departement Molecular and Cellular Biology, en ik ben Cecilia Moans van de Division of Basic Science bij het Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle. Vandaag gaan Cecilia en ik het protocol voor de cryopreservatie van zebravisperma demonstreren, wat een modificatie is van het oorspronkelijke Brian Harvey-protocol. We zullen laten zien dat het, door in teams van twee te werken, mogelijk is om sperma van 100 individuele mannetjes in minder dan twee uur te cryopreserveren.

Hoewel de fertiliteit na het ontdooien sterk kan variëren, is de gemiddelde fertiliteit die we waarnemen 25%, en dit is afkomstig uit een bibliotheek die al meer dan zeven jaar is cryopreserveerd. Laten we beginnen. Maak eerst de spermiabvriesoplossingen voordat u deze procedure uitvoert.

De Ginsburg Fish ringer-oplossing wordt elke drie dagen vers bereid, en het vriesmedium wordt dagelijks vers bereid, zowel met als zonder methanol. De samenstelling van deze oplossingen is te vinden in de online aanvullende informatie bij dit protocol. De materialen die bij deze procedure worden gebruikt, kunnen de snelheid van het vriezen en ontdooien beïnvloeden, wat op zijn beurt de fertiliteit van bevroren sperma kan beïnvloeden.

Om deze reden wordt er ook een lijst met aanbevolen materialen verstrekt als aanvullende online informatie. Het is raadzaam om het sperma te invriezen op fijngecrusht droogijs in plaats van op droogijs-pellets. Een eenvoudige manier om droogijs te crushen is door het in een handdoek te wikkelen en het met een hamer te verbrijzelen.

Een efficiëntere methode is het gebruik van een droogijs-molen, zoals een claws en model RE twee, om zebravisperma te vriezen. Markeer eerst capillaire buisjes van 10 µL met een laboratoriumstift op het niveau van 3,33 µL of ongeveer 16,7 mm vanaf de bodem. Om de mannetjes te anesthetiseren, plaatst u twee tot vier mannetjes in een bekerglas met verdunde trica in viswater. Het recept hiervoor kan worden gevonden in het zebravisboek.

Zodra de vissen zijn gebenestheseerd, tilt u ze met een plastic lepel uit het anestheticum en dept u ze voorzichtig droog op een papieren handdoek. Besteed speciale aandacht aan het droogmaken van de ventrale zijde. Water activeert sperma, dus het is cruciaal om rond de ika grondig te drogen.

Positioneer de vis met de ventrale zijde naar boven op de sponshouder. Als de regio rond de buikvinnen nog vochtig is, droog deze dan voorzichtig af met een Kim wipe. Plaats de gemarkeerde capillaire buis in een rubberen mondpipetadapter die bij de capillaire buizen is meegeleverd.

De adapter is een rubberen slang met een mondstuk aan het ene uiteinde en een capillairhouder aan het andere uiteinde. Alternatief kan de capillaire buis worden verbonden met een Hamilton-spuit van 50 µL. Plaats het mannetje onder de microscoop met behulp van een kort stukje Tigon-slang van de juiste diameter en leg de urogenitale opening vrij door de bekkenvinnen voorzichtig uit elkaar te spreiden.

Druk het sperma uit door met een gladde pincet voorzichtig langs de flanken van de vis te strijken of door de flanken van de vis voorzichtig tussen de wijsvinger en duim samen te knijpen; gebruik het uiteinde van een capillaire buis om het sperma bij het uitstoten met een lichte zuigkracht op te vangen. Vermijd feces die samen met het sperma kunnen worden uitgestoten. Het streefvolume van het sperma is 3,3 microliters.

De minimale acceptabele hoeveelheid sperma varieert afhankelijk van de kwaliteit van het sperma. Goed sperma is wit en opaak, terwijl arm sperma er waterig uitziet. In het algemeen is de minimale acceptabele hoeveelheid sperma 1 µL goed sperma of een derde van het doelvolume, en 2 µL arm sperma of twee derde van het doelvolume.

Als het spermavolume het doelvolume van 3,3 µL niet bereikt, moet het volume worden genormaliseerd tot de streep op de pen met behulp van vriesmedium zonder methanol. Als het spermavolume de streep op de capillaire buis al bereikt of overschrijdt, ga dan door naar de volgende stap. Voeg nu de cryoprotectant toe aan het sperma.

Zuig vriesmedium met methanol op tot aan de oranje markering. Het totale volume is nu ongeveer 20 µL. Breng het mengsel van sperma en cryoprotectant voorzichtig over op een schoon gedeelte van een horlogeglas en meng dit door ongeveer vier keer op en neer te pipetteren, waarbij moet worden voorkomen dat er luchtbellen ontstaan.

Verdeel het sperma over twee cryovials door 10 µL van de cryoprotectieve spermaoplossing in de bodem van elke gelabelde vial te pipetteren. Sluit de vials snel af en plaats elke cryovial in een aparte Falcon-buis van 15 mL. Sluit de Falcon-buizen bij kamertemperatuur af en plaats ze in fijngepoederd droogijs.

De buisjes moeten diep genoeg worden ingebracht, zodat alleen de doppen zichtbaar zijn, om het overzicht over de falcon-buisjes te bewaren. Nummer ze en noteer het tijdstip waarop elk buisje in het droogijs wordt geplaatst. Laat het sperma 20 minuten bevriezen in het droogijs.

Nadat het sperma is ingevroren, worden de twee cryovials overgebracht naar een Dewar-fles met vloeibare stikstof voor tijdelijke opslag. Plaats de vriesbox in een bad van vloeibare stikstof zodat de monsters niet opwarmen.

Gebruik lange metalen tangen om de vials uit de Dewar-kolf te halen en hanteer deze met cryo-handschoenen. Als alternatief kunnen cryovials direct van het droogijs naar de vriezer worden overgebracht. Indien de vriezerbox voor langetermijnopslag in een piepschuimcontainer ondergedompeld in vloeibare stikstof wordt bewaard, plaats de cryovials dan in een cryogene vloeibare stikstofvriezer.

Om de levensvatbaarheid van het sperma te behouden, is het cruciaal dat de vials ondergedompeld in vloeibare stikstof worden bewaard; vials die in de dampfase worden bewaard, kunnen na verloop van tijd hun levensvatbaarheid verliezen. Snelheid is eveneens van doorslaggevend belang voor het behoud van de levensvatbaarheid van het sperma. De tijd tussen het toevoegen van het cryoprotectivum en het plaatsen van de spermavials op droogijs mag niet meer dan 30 seconden bedragen bij in vitro fertilisatie.

Het gebruik van cryobewaard sperma werkt het beste met twee personen. Eén persoon klemmet de eitjes uit de vrouwtjes, terwijl de andere persoon het sperma ontdooit. Stel een waterbad in op 33 °C.

Haal een cryovial uit de vloeibare stikstofvriezer en breng deze over naar een vat of kolf met vloeibare stikstof tot het moment van ontdooien. Knijp de eitjes uit genetarte vrouwtjes in een plastic Petrischaal van 35 millimeter. Dit wordt uitgebreid beschreven in het JoVE-protocol met de titel Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure, waarin een gedetailleerde beschrijving van zebrafish wordt gegeven.

Bij in vitro fertilisatie bevat een goede clutch meer dan 150 eieren die uniform en gelig zijn. Elk wit residu is indicatief voor degradatie. Probeer indien mogelijk drie clutches eieren te verkrijgen en deze in één schaal te combineren.

Als er binnen één minuut na de eerste clutch geen drie goede clutches zijn verkregen, ga dan door naar de volgende stap. Houd de schaal afgedekt terwijl het sperma ontdooit. Verwijder ondertussen het vials uit de vloeibare stikstof en verwijder de dop.

Dompel het vial snel gedurende acht tot 10 seconden tot de helft onder in een waterbad van 33 °C. Voeg snel 70 µL kamertemperatuur, Hank's gebufferde zoutoplossing toe aan het vial en meng door te pipetteren; voeg dit onmiddellijk toe aan de eitjes in de Petrischaal en meng voorzichtig met de pipetpunt. Activeer vervolgens onmiddellijk de sperma en eitjes door 750 µL viswater toe te voegen, draai het mengsel om en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur.

Vul na vijf minuten de schaal met vissen en water en incubeer bij 28 °C. Tel na twee tot drie uur de levensvatbare embryo's en breng deze over naar schalen van 100 mm, met 50 embryo's per schaal. Tel daarnaast het aantal bevruchte eieren, zodat de fertiliteit van het spermaproefmonster kan worden bepaald.

Spermafertiliteit is de verhouding tussen levensvatbare embryo's en het totale aantal eicellen dat is gebruikt voor de in vitro fertilisatie. Eicellen kunnen op elk moment tussen twee en zes uur na de in vitro fertilisatie worden gesorteerd. Wanneer infertiele eicellen gemakkelijk te onderscheiden zijn van levensvatbare embryo's, zijn de infertiele eicellen helder en ongedeeld.

Wanneer bekeken met trans-illuminatie op een stereomicroscoop, varieert de gemiddelde fertiliteit van cryopreservated sperma sterk. Het zou echter mogelijk moeten zijn om een gemiddelde fertiliteit van 25% te bereiken die gedurende meerdere jaren stabiel blijft. Deze grafiek toont het gemiddelde fertiliteitspercentage van sperma dat is ingevroren tussen 2001 en 2003 en is ontdooid tot recent als 2008.

We hebben zojuist een methode met een hoge doorvoer gedemonstreerd voor de cryopreservatie van visperma. Bij het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om al het aanbevolen plastic materiaal en de apparatuur te gebruiken, en om gepulveriseerd, verbrijzeld droogijs te gebruiken in plaats van droogijs-pellets. Het is essentieel om sperma en eitjes van zeer hoge kwaliteit te gebruiken; in het geval van de eitjes bij de in vitro fertilisatie na het ontdooien van het sperma, is het belangrijk om een zo groot mogelijk aantal eitjes te gebruiken om het aantal vruchtbare embryo's aan het einde van het proces te verhogen, waarvoor mogelijk drie tot vier vrouwtjes nodig zijn.

Een ander essentieel onderdeel van het protocol is de snelheid. Het mag nooit langer duren dan ongeveer een minuut om van het uitdrukken van het sperma van het mannetje naar het plaatsen ervan in het droogijs te gaan. Nou, ik denk dat dit alles is.

Veel succes met uw experimenten.