Global analyse van genexpressie met behulp van een zebravis oligonucleotide microarray platform

Deze procedure begint met cDNA dat is gesynthetiseerd uit een template van hoogwaardig RNA. Het cDNA wordt eerst gelabeld met de fluorescente kleurstof Cy3. Na voltooiing van de labelingsreactie wordt het gelabelde cDNA gezuiverd en geïsoleerd, waarna de kwaliteit van de labelingsreactie wordt beoordeeld.

Het gelabelde cDNA wordt vervolgens gehybridiseerd op een microarray. Na de hybridisatie worden de arrays geanalyseerd om de relatieve niveaus van genexpressie in de monsters te bepalen. Hallo, mijn naam is Sam Peterson van het laboratorium van Dr. Jennifer Freeman aan de School of Health Sciences van Purdue University.

Eerder hebben we u laten zien hoe u RNA uit zebravisembryo's extraheert en dat RNA omzet in cDNA. Vandaag laten we u de procedure zien voor het labelen en hybridiseren van dat cDNA op een oligonucleotide-microarrayplatform voor zebravis om globale genexpressieprofielen te bestuderen. Normaal gesproken gebruiken we deze procedure om differentiële genexpressie als reactie op blootstelling aan een toxine te bestuderen.

Laten we beginnen. Het microarray-experiment vereist een omgeving met minimaal licht om fotodegradatie van de fluorescerende kleurstof Cy3 te voorkomen, die wordt gebruikt bij de labeling. Om de cDNA te labelen met Cy3, gebruikten we de volgende componenten van het BioPrime Array CGH Genomic Labeling System: 2,5 x random primer buffer, 10 X dNTP-mix en nucleasevrij water. Ontdooi daarnaast de 1 millimolaire stockoplossing van de Cy3-gelabelde dCTP. Centregeer de reagentia na het ontdooien kortstondig in een 0,6 milliliter dikwandige buis.

Voeg 500 nanogram cDNA, 40 µL 2,5 x random primer buffer en nucleasevrij water toe om een totaalvolume van 86 µL te bereiken. Meng goed en centrifugeer kort, en incubeer de reactie vervolgens vijf minuten bij 100 °C in een thermocycler. Breng de reactie direct na de incubatie voor 10 minuten over naar een ijsbad.

Haal vervolgens de exo DNA-polymerase uit de vriezer en plaats deze op ijs. Voeg vervolgens aan de reactiebuis 10 µL van de 10 X-D-C-T-P Mix, 2 µL van de 1 mM SI 3D CTP en 2 µL van de XO cleanout DNA-polymerase toe, meng goed en centrifugeer kort. Incubeer de reactie tot slot in een thermocycler gedurende 16 uur bij 37 °C tot de labelingsprocedure is voltooid.

Ga over tot het zuiveren en neerslaan van het gelabelde cDNA. Om te beginnen met het zuiveren van het gelabelde cDNA, plaatst u een MicroCon-kolom in een buisje van 1,5 milliliter.

Voeg 300 µL 0,1 X SSC toe aan de kolom en voeg vervolgens de labelingsreactie toe. Centrifugeer de kolom 10 minuten bij 16.100 ×g bij 4 °C. Let op dat de doorstroom lichtroze kan zijn.

Gooi de doorstroomvloeistof weg en voeg nog eens 300 µL 0,1 X SSC toe aan de kolom. Herhaal vervolgens de centrifugatie bij 16.100 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Gooi opnieuw de doorstroomvloeistof weg en voeg nogmaals 300 µL 0,1 X SSC toe aan de kolom; centrifugeer na deze laatste wasbeurt bij 16.100 G gedurende 12 minuten bij vier graden Celsius.

De doorstroomvloeistof moet helder zijn en het roze gelabelde cDNA moet zichtbaar zijn op de kolom. Verwerp opnieuw de doorstroomvloeistof van deze laatste wasstap om het gelabelde cDNA te elueren. Voeg 100 µL nucleasevrij water toe aan de kolom. Neem de kolom uit de microcentrifugebuis en plaats deze omgekeerd in een nieuwe buis.

Centrifuge vervolgens de omgekeerde kolom 2 minuten bij 2.300 G bij vier graden Celsius. Het gelabelde cDNA is opgelost in het water onderaan de buis. Controleer het verkregen cDNA met een NanoDrop ND 1000 spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant.

Bereken de DNA-concentratie en evalueer de kleurstofincorporatie zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol. Als het cDNA voldoende is gelabeld, breng dan zes microgram over naar een nieuwe buis om het gelabelde cDNA-mengsel neer te slaan in 0,1 x volume drie molar natriumacetaat bij pH 5.2 en één x volume isopropanol, gevolgd door incubatie in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Houd er rekening mee dat alle stappen tot dit punt in een omgeving met minimale lichtblootstelling zijn uitgevoerd. Centrifugeer het monster vervolgens bij 16.100 G gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na centrifugatie voorzichtig het supernatant zonder het roze DNA-pellet te verstoren.

Was ten slotte door 500 µL 70% ethanol toe te voegen en meng door voorzichtig om te keren; centrifugeer bij 16.100 G gedurende vijf minuten. Verwijder bij kamertemperatuur het supernatant, keer de buis om en laat het pellet vijf minuten drogen. Het gelabelde cDNA is nu klaar voor hybridisatie.

Schakel vóór aanvang van de hybridisatie het NimbleGen hybridisatiesysteem in en laat het stabiliseren op 42 °C. Begin met het oplossen van het gelabelde CD NA-pellet in 5 µL nucleasevrij water tot het pellet volledig is opgelost. Voeg de hybridisatiecomponenten uit de Roche NimbleGen Hybridization kit (Hybridization buffer hybrid A en alignment-oligo) toe tot een totaalvolume van 18 µL, zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol.

Meng goed en centrifugeer de buis kort om de inhoud op de bodem te verzamelen. Denatureer vervolgens het gelabelde cDNA door de buis vijf minuten op 95 °C te plaatsen. Plaats de buis onmiddellijk in het NimbleGen-hybridisatiesysteem tot de arrays gereed zijn.

Let op dat de microarrays zorgvuldige behandeling en opslag vereisen. Roche nimble gen arrays worden donker bewaard met een droogmiddel bij kamertemperatuur. Plaats de array in het uitlijningsinstrument van de precisiemixer.

Laad de PMA T load in X één mixer op de PMA T en verwijder de plakstrip met een pincet. Sluit de PMA T stevig zodra de array en de mixer zijn geladen. Koppel vervolgens de array en de mixer los van de PMA T door druk uit te oefenen op de mixer via het gat in de PMA t.

Gebruik ten slotte een handroller om druk uit te oefenen rond de buitenkant van de mengmodule om er zeker van te zijn dat de array is afgesloten en om eventuele luchtbellen te verwijderen. Plaats vervolgens het array-mengcomplex op het hybridisatiesysteem om op te warmen en het cDNA-monster op de array te laden. Gebruik de verplaatsingspomp langzaam en met een constante druk.

Voeg 15 µL van het gelabelde monster toe aan de vulpoort in het midden van de mixer. Veeg overtollig monster van de poortopeningen en sluit deze af met plakstrips. Sluit vervolgens de vergrendeling.

Start nu met het mengen van de hybridisatie-oplossing met behulp van programma B op het nimble gen hybridisatiesysteem. Laat de microarray 16 tot 20 uur hybridiseren. Na de hybridisatie zal de microarray worden gewassen en gescand wanneer de hybridisatie bijna voltooid is. Bereid het scannen voor door de gene picks 4.000 B array scanner in te schakelen en laat deze ongeveer 15 minuten opwarmen.

Bereid vervolgens wasbuffers één A, één B, twee en drie voor zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol. Voorverwarm wasbuffer één A tot 42 °C, maar laat de andere buffers op kamertemperatuur. Zodra wasbuffer één A is opgewarmd, wordt deze in een schaal gegoten.

Dompel een objectglasrek onder in wasbuffer één B. Verwijder nu het array-mengercomplex uit het NimbleGen hybridisatiesysteem en schuif dit in de jig. Start het wassen door de assemblage onder te dompelen in de voorverwarmde wasbuffer één A en verwijder voorzichtig de menger door deze van het objectglas af te pellen. Verwijder vervolgens de array uit de jig en agiteer deze gedurende 15 seconden in wasbuffer één A. Verplaats de array snel naar een objectglasrek dat is ondergedompeld in wasbuffer één B en agiteer het objectglasrek krachtig gedurende twee minuten.

Plaats het platenrek vervolgens in wasbuffer twee en schud een minuut lang. Plaats het platenrek tot slot in wasbuffer drie en schud 15 seconden. Voltooi de wasstappen door de array over te brengen naar de centrifuge voor het drogen van platen en centrifugeer twee minuten lang.

Scan de array onmiddellijk aangezien de D gevoelig is voor licht en ozon; start het scannen door de array met de barcode naar beneden in de gene picks 4, 000 B array-scanner te laden. Stel in het dialoogvenster voor hardware-instellingen de PMT-waarde voor de 532 nanometer laser in op 500, zet het vermogen op 100%, de pixelgrootte op vijf microns, het aantal gemiddelde lijnen op één en de focuspositie op nul microns. Wanneer de configuratie is voltooid, maak dan een preview van de array.

Kies een gebied om te scannen en scan dit vervolgens. Controleer na voltooiing van het scannen het histogram van het beeld. Idealiter moet één E minus vijf genormaliseerde tellingen op de verzadigingslimiet van 65.000 liggen, wat betekent dat ongeveer 1 tot 2% van de kenmerken verzadigd is.

Als de genormaliseerde tellingen minder zijn dan 1E-5, verhoog dan de PMT-versterking en scan de slide opnieuw. Als de genormaliseerde tellingen groter zijn dan 1E-5, verlaag dan de PMT-versterking en scan de slide opnieuw, sla de afbeelding op en gebruik een data-analyseprogramma voor datanormalisatie en de berekening van intensiteitswaarden. De labelingsreactie levert routinematig ten minste 10 µg gelabeld cDNA op.

De kleurstofincorporatie kan worden berekend met een eenvoudige basiskleurverhouding waarbij de verhouding nucleotide tot SI three gelijk is aan de verhouding A two 60 tot a five 50 vermenigvuldigd met 23 point 15. Een goede reactie resulteert in een waarde tussen 50 en 80. Bij een acceptabele hybridisatie zal 1 tot 2% van de kenmerken verzadigd zijn.

Eén E minus vijf genormaliseerde counts bij de verzadigingslimiet van 65.000. Met de PMT-waarde ingesteld rond 500 kan de hybridisatiekwaliteit ook kwalitatief worden beoordeeld door de gescande afbeelding van de microarray te bekijken en de intensiteit van de uitgelijnde oligos te vergelijken met andere kenmerken op de array. De gescanne afbeelding moet ook worden gecontroleerd op specifieke vlekken of stofdeeltjes binnen het arraygebied.

In een daaropvolgende analyse kan een spreidingsdiagram worden gebruikt om uw geanalyseerde gegevens weer te geven om de relatieve niveaus van genexpressie in de monsters te bepalen en om genen te identificeren die differentieel tot expressie komen. Genen die differentieel tot expressie komen, zullen significant afwijken van de best-fitlijn. In een aanvullende procedure hebben we u laten zien hoe u RNA uit zebravissenembryo's extraheert en synthetiseert tot cDNA. Hier hebben we u zojuist laten zien hoe u cDNA labelt en hybridiseert op een oligonucleotide-microarrayplatform om globale genexpressieprofielen te bestuderen.

Houd bij het uitvoeren van deze procedure altijd rekening met het gebruik van hoogwaardige CD NA en voorkom dat de site three-kleurstof wordt blootgesteld aan direct licht. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.