Mozaïek zebravis Transgenese voor het evalueren van Enhancer Sequences

Hoi, ik ben Erica Kgi van het laboratorium van Shannon Fisher van de afdeling Cel- en Ontwikkelingsbiologie aan de University of Pennsylvania. Ik ben Chris Weber, ook van het Fisher Lab. En ik ben Shannon Fisher.

Vandaag tonen we u een procedure voor het analyseren van de functie van enhancer-elementen met behulp van transgenese in zebravissen. We gebruiken deze procedure om de transcriptionele regulatie van genen te bestuderen die belangrijk zijn voor de skeletontwikkeling. Laten we beginnen.

Om niet-coderende sequenties rond kandidaatgenen te identificeren, gebruiken we het algoritme fast cons, dat toegankelijk is als een track in de uc SC genome browser. We zijn primair geïnteresseerd in genen die tot expressie komen tijdens de skeletontwikkeling, maar dezelfde aanpak kan worden gebruikt om elk gen te bestuderen dat tot expressie komt tijdens de vroege ontwikkeling. In het hier getoonde voorbeeld hebben we geconserveerde sequenties geïdentificeerd.

In het interval rondom het menselijke bumper-gen onderzoeken we het gehele interval tot aan de aangrenzende genen en bepalen we een lage, grootte-specifieke log-score-afkapwaarde die overeenkomt met ongeveer de top 5% van de niet-coderende sequentie. Na het selecteren van sequenties ontwerpen we primers met behulp van Primer3 om elke sequentie uit menselijk genomisch DNA te amplificeren; primers moeten worden gekozen om de geconserveerde regio plus 30 of meer basenparen aan weerszijden te amplificeren. Amplificeer de regio van interesse met een hoogwaardige polymerase met gebruik van menselijk genomisch DNA en gebruik standaard laboratoriumprocedures voor moleculaire biologie om het geamplificeerde product in een expressievector te kloneren.

De vector die in dit protocol wordt gebruikt is PG wc FOS GFPA gateway. Bestemmingsvector. Na de vectorcreatie wordt er instructie gegeven om te transponeren.

Het enzym dat nodig is voor transpositie wordt voorafgaand aan de experimentele injecties eerst in vitro getranscribeerd met behulp van de M message M machine kit van Ambion en het PGB 600-plasmide. Test elke batch transposasen op werkzaamheid door te injecteren met een bekende enhancer, zoals de muis socks. 10 enhancer.

Trek ter voorbereiding op de injecties de naalden voor micro-injectie uit filamentcapillairglas met een buitendiameter van 1,2 millimeter met een Sutter P 97 micropipet-puller. Gebruik een programma dat een stevige tip met een scherpe tapsheid oplevert om intacte chorions door te kunnen dringen met een schoon scheermesje en een micrometerplaatje. Breek de tips handmatig onder een stereomicroscoop tot een buitendiameter van ongeveer 15 micrometer.

De naalden kunnen gedurende een dag worden bewaard in een afgedekte bewaarschaal. Houd de zebravispopulatie de dag vóór het uitvoeren van de micro-injecties op een regelmatige licht-donkercyclus met 14 uur licht onder standaardcondities. Bereid de vissen voor op getimede paringen in kleine kweekbakken.

Plaats op de ochtend van de micro-injecties, kort na het begin van de lichtcyclus, drie vrouwtjes of twee mannetjes per tank in parallelle rijen. Combineer mannetjes en vrouwtjes in schoon, behandeld systeemwater voor de eiproductie. Controleer de vissen regelmatig en verzamel de eieren binnen enkele minuten na de productie om goed gesynchroniseerde batches te verkrijgen.

Houd de eiproductie gedurende twee tot drie uur op gang door gedurende de ochtend telkens nieuwe groepen vissen te combineren met een glazen pasteurpipet met een wijde opening van 5,25 inch, voorzien van een latex ballon. Verdeel de verzamelde embryo's in groepen van 50 embryo's over Petrischalen van 60 bij 15 millimeter, die gedeeltelijk zijn gevuld met embryo-medium. Noteer het tijdstip van verzameling op het deksel van elke schaal.

Bewaar voor elk verzamelde nest embryo's een schaal met 50 embryo's als niet-geïnjecteerde controle tussen de eiverzamelingen door. Bereid verse injectie-oplossingen door de volgende ingrediënten in een microcentrifugebuis te mengen en bewaar deze op ijs. Leg de injectienaalden in bewaarschalen en vul deze met 1,5 tot 2 µL injectie-oplossing.

Pipetteer druppels van 500 nanoliter op het brede uiteinde van elke naald. De vloeistof zal door capillaire werking naar de punt worden getrokken. Bereid ten minste twee naalden voor per injectieoplossing.

Plaats de gevulde naald in de handgreep van een pneumatische picopomp of een soortgelijke drukinjector. Deze dient te zijn geconfigureerd en aangesloten op een stikstoftank volgens de instructies van de fabrikant. Kalibreer de injectievolumes door de diameter van druppels te meten die in minerale olie op een micrometerglasplaat worden geïnjecteerd, gewoonlijk met een injectietijd van 120 milliseconden.

Met een druk van 20 PS produceer ik een druppel van ongeveer één nanoliter met behulp van een stereomicroscoop bij een vergroting van 6 tot 10 x. Houd het embryo op zijn plaats met een fijne pincet en duw de injectienaald met een gelijkmatige druk door het chorion in het dooereiland van een embryo in het ééncellige of vroege tweekellige stadium; positioneer de naaldpunt in het dooereiland net onder de blastomeren, voer ongeveer één nanoliter injectieoplossing toe en trek de naald terug. Voor elk construct injecteren we 200 of meer embryo's. Nadat de injecties zijn voltooid, worden de embryo's gesorteerd door onbevruchte eieren, beschadigde embryo's en mislukte injecties of embryo's zonder fenolrood in de blastomeren te verwijderen.

Vervolgens incuberen we de embryo's en het embryo-medium bij 28,5 °C tot het juiste tijdstip voor de waarnemingen. Nu tonen we u enkele representatieve resultaten van enhancer-elementen die weefselspecifieke patronen van GFP-expressie produceren in het zebravissenbryo. We bestuderen genen die tot expressie komen in bot of kraakbeen tijdens.

Hier is een voorbeeld van een enhancer-element stroomopwaarts van het acan-gen dat de expressie in het kraniofaciale kraakbeen reguleert op drie dagen na bevruchting. Hier is een andere enhancer, ditmaal van het bumper-gen, die de expressie in botcellen reguleert. Op vijf dagen zien we, van de vele enhancers die we hebben geïdentificeerd, weinig correlatie tussen de locatie ten opzichte van het gen en de regulatie van de expressie.

Bij het kiezen van sequenties om te testen, is het belangrijk om te onthouden dat een enhancer honderden kilobasen stroomopwaarts of stroomafwaarts van een gen kan liggen, of in een van de intronen, zoals te zien is in dit embryo. Een aanzienlijk deel van de sequenties lijkt weefselspecifieke expressie niet te reguleren. Deze vertonen vaak zeer weinig fluorescentie of kunnen enkele verspreide cellen vertonen op twee veelvoorkomende locaties voor ectopische expressie: de epidermis en de skeletspieren.

We hebben zojuist laten zien hoe u potentiële enhancer-elementen kunt identificeren via sequentieconservatie en hun functie kunt testen via mozaïek-transgenese in zebravis. Wanneer u deze procedure uitvoert, is het belangrijk om de kwaliteit van uw DNA en RNA voor injecties te controleren. Zorg er daarnaast voor dat u alle geïnjecteerde embryo's zorgvuldig onderzoekt, vooral als u expressie slechts in een kleine groep cellen verwacht.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.