Lentivirus Productie

Deze procedure begint met het transfecteren van 2 9 3 T-cellen met lentivirus, plasmide en virale verpakkingsvectoren; het virale supernatant wordt geoogst na een incubatieperiode van ten minste 48 uur. Het supernatant wordt gefiltreerd om vervolgens met een ultracentrifuge te worden geconcentreerd. De virale pellet wordt geresuspendeerd in PBS om de virustiter te bepalen; verdun eerst het geconcentreerde virus in compleet medium en voer daarna seriële verdunningen uit om cellen te infecteren met het lentivirus.

Hoi, ik ben Shein Wong van het laboratorium van Michael McManus bij het Diabetes Center van de University of California San Francisco. Ik ben Michael McManus. Vandaag laten we u een procedure zien voor de productie van lentivirussen.

We gebruiken deze procedure in het laboratorium om lentivirussen te maken voor RNA-interferentie. Laten we beginnen. Om dit protocol te starten, bereidt u het DNA voor waarmee de 2 9 3 T-cellen worden getransfecteerd.

Verdun eerst FU gene six transfectiereagens in een buisje van 1,5 milliliter door 30 µL Fuji six te mengen met 600 µL serumvrij medium. Zorg ervoor dat Fuji de wand van het buisje niet raakt terwijl u het in het medium toevoegt; incubeer vijf minuten op kamertemperatuur. Meng vervolgens, in de dop van het buisje, 4 µg lentiviraal plasmide met 1,33 µg.

Elk is een viraal verpakkingsvector van de derde generatie. Het lentivirale plasmide bevat het DNA. Het virus zal zich integreren in het genoom van elke cel die het infecteert, terwijl de verpakkingsvectoren genen bevatten voor alle andere eiwitten die nodig zijn om een lentivirus te maken; sluit de dop en meng door de buis een paar keer om te keren.

Incubeer het DNA en het transfectiereagens 15 tot 20 minuten bij kamertemperatuur. Het is nu tijd om de 293-cellen te transfecteren met het door u voorbereide DNA; gebruik hiervoor cellen die u 24 uur vooraf heeft geplaatst en die een confluentie van 50 tot 70% hebben bereikt. Pipetteer in de weefkweekkap al het voorbereide DNA op de 293-plaat. Meng voorzichtig door de plaat heen en weer te kantelen, plaats de cellen terug in de incubator en laat de virale productie 48 tot 96 uur voortduren vóór de oogst. Tijdens de incubatie produceren de 293-cellen lentivirussen waarvan de genomen een RNA-kopie bevatten van uw DNA van interesse.

Het is nu tijd om het virus te oogsten. Haal de cellen uit de incubator. Zet een spuitfilter van 0,4 of 5 micron, een wegwerpspuit van 10 milliliter en een UltraClear Beckman centrifugebuis klaar in de steriele werkbank.

Gebruik de wegwerpspuit om het supernatant, waarin zich nu het virus bevindt, te verwijderen. Bevestig een spuitfilter van 0,45 micron aan de punt en filtreer het virus in een UltraClear Beckman centrifugebuis. Het filter laat alleen virussen en geen cellen door; gooi deze vervolgens weg en incubeer alle virusproducerende cellen.

Kweekplaten, spuiten en filters gedurende 45 minuten in 10% bleekmiddel weken. Nu het virus is verzameld en gefilterd, is het tijd om het virus eerst te concentreren via ultracentrifugatie. Gebruik serumvrij DMEM om alle buizen met virus zo te balanceren dat het gewichtsverschil tussen elkaar maximaal 0,2 gram is.

Laad vervolgens de gebalanceerde centrifugebuizen in de SW 41 TI of SW 28 rotorbuckets. Sluit de rotorbuckets af en bevestig ze aan de rotor. Plaats daarna de rotor in de ultracentrifuge.

Centrifugeer het virus gedurende ongeveer 90 minuten bij vier graden Celsius op 25.000 RPM in een SW 41 TI rotor, of op 24.000 RPM in een SW 28 rotor. Keer na centrifugatie terug naar de celkweekkast en keer de buis om om het SNAT in een container met 10% bleekloog te gieten. Gebruik een Kim wipe om overtollige vloeistof rond de pellet te absorberen en plaats de buis ondersteboven in een geschikt rek voor maximaal vijf minuten, totdat u klaar bent om de pellet te resuspenderen.

Voeg 100 µL steriele, vooraf gefiltreerde PBS toe aan de buis met een filtertip om het virale pellet opnieuw op te lossen. Pipetteer vervolgens ongeveer 20 keer op en neer. Laat het virus een nacht bij 4 °C staan om de resuspensie te voltooien.

Virale preparaten kunnen ongeveer één week bij vier graden en tot één jaar bij min 80 graden worden bewaard. Vergeet niet om alle lege buisjes te behandelen met 10% bleekmiddel voordat u ze weggooit. Als u van plan bent het virale preparaat langer dan één week te gebruiken, kan dit in de koelkast worden bewaard.

Maak minimale aliquots van 5 tot 20 µL voor toekomstige experimenten en één aliquot van 3 tot 5 µL voor de titratie-freeze, en bewaar de aliquots bij ongeveer -80 °C. De volgende stap is het bepalen van de virale titer. Als u een fluorescent reportergen in uw lentiviraal plasmide heeft opgenomen, zullen geïnfecteerde cellen fluoresceren en kunt u de virale titer bepalen met behulp van flowcytometrie.

Begin met het verdunnen van drie µL geconcentreerd virus in 1,5 mL compleet medium in de putjes één tot en met zes, in een enkele rij van een 96-well plaat. Voer de volgende seriële verdunningen uit in alle zes de putjes met 100 µL compleet DM. Voeg aan het eerste putje 100 µL medium zonder virus toe.

Dit is uw ongekleurde controle. Voeg aan de tweede put 100 µL van het verdunde virus toe. Voeg aan de derde put 100 µL van het mengsel uit de tweede put toe aan de vierde.

Voeg 100 µL van de derde well toe aan de vijfde. Voeg 100 µL van de vierde well toe aan de zesde. Voeg 100 µL van de vijfde well toe.

Neem ten slotte 100 µL uit het zesde putje, gooi dit weg en bleek het. Breng het totale volume in alle putjes aan met DMEM tot 200 µL. Bij elke verdunning wordt de virusconcentratie gehalveerd. Let op dat dit slechts voorgestelde verdunningen zijn, die goed zouden moeten werken voor het titreren van de meeste geconcentreerde virussen.

Als uw virus een lage titer heeft of niet is geconcentreerd, moet u mogelijk uw verdunningen aanpassen. Behandel elk ongebruikt verdund virus gedurende 45 minuten met 10% bleekmiddel voordat u het in een container voor biologisch gevaarlijk afval werpt. Voeg ongeveer 15.000 gezonde, actief delende 2 9 3 T-cellen toe aan elk van de zes wells.

U kunt een enkele 96-wells plaat gebruiken om 16 virale preparaten te titeren; vul de wells aan tot 200 µL, plaats de cellen terug in de incubator en laat de infectie gedurende ten minste 48 uur doorgaan. Analyseer na de incubatie de celfluorescentie met behulp van een flowcytometer. U kunt het percentage fluorescerende cellen per well gebruiken om de titer of het aantal infectieuze virale deeltjes per milliliter toegevoegd virus te bepalen.

Bereken het aantal infectieuze eenheden per milliliter met de volgende formule bij het interpreteren van de resultaten van de flowcytometer. Houd er rekening mee dat nauwkeurige titerberekeningen alleen mogelijk zijn wanneer geïnfecteerde cellen niet meer dan één virale integratie per cel hebben ondergaan.

Om er zeker van te zijn dat dit het geval is, moeten cellen met een infectiegraad van minder dan 15% worden gebruikt voor de berekeningen. Cellen met hogere infectiegraden hebben waarschijnlijk meerdere virale integraties per cel ondergaan. De verdunning die in stap twee wordt gesuggereerd, zou verschillende monsters binnen dit bereik van infectie moeten opleveren.

Gebruik bij voorkeur meerdere monsters om een titratiecurve te genereren waarmee de uiteindelijke titer kan worden berekend. De formule uit de gefitte lineaire lijn kan worden gebruikt om de virale titer te bepalen, maar indien nodig kan de titer ook met één enkel monster worden berekend. Men kan een titer van 1 x 10⁷ transducerende eenheden per milliliter verwachten voor niet-geconcentreerd virus, en 1 x 10⁸ transducerende eenheden per milliliter voor geconcentreerd virus.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u lentivirussen produceert bij het uitvoeren van deze procedure. Het is belangrijk om alle biosafety-voorschriften na te leven en afval op de juiste wijze af te voeren. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.