Verpakking HIV-of FIV-based Lentivector expressie constructen en transductie van VSV-G pseudogetypeerde virale deeltjes

Het algemene doel van deze procedure is om te leren over lentivirale packaging. Een protocol van vijf dagen. Op de eerste dag worden 2 9 3, TN producer-cellen uitgeplaat door middel van een berekende dichtheid.

Op de tweede dag worden de cellen getransfecteerd met het gekozen lenti-vectorconstruct dat het gen van belang bevat en een mix van virale verpakkingsplasmiden. Op dag vier wordt het virale supernatant geoogst en geconcentreerd door toevoeging van een PEG-virusprecipitatie-oplossing. De laatste stappen van de procedure zijn het oogsten van het PEG-geconcentreerde virus, het verdelen van het virus in aliquots en het infecteren van cellen met het geconcentreerde virus voor virale titratie.

Uiteindelijk wordt kwantitatieve PCR van stabiel geïntegreerde genen gebruikt om het aantal stabiel geïntegreerde constructen te berekenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals plasmatransfectie of retrovirale transductie, is dat het geoptimaliseerde lentivirus-verpakkingsprotocol van FBI een functioneel actief virus met een hoge titer produceert, wat een efficiënte aflevering in bijna elke zoogdiercel mogelijk maakt, inclusief moeilijk te transfecteren cellen zoals stamcellen en niet-delende primaire cellen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben omdat zij niet bekend zijn met de kleine protocolgegevens, die essentieel zijn voor de succesvolle productie van virus met een hoge titer.

Een visuele demonstratie van deze methode is nuttig, aangezien de celdichtheid die via een microscoop tijdens transfectie wordt gevisualiseerd, de efficiëntie van de virale verpakking bepaalt, wat op zijn beurt de uiteindelijke virale titer bepaalt. In gevallen waarin dit van toepassing is, bepaalt de expressie van een fluorescente reporter de transfectie-efficiëntie, wat een significante invloed heeft op de uiteindelijke virale titer. Daarnaast is een visuele demonstratie van deze methode behulpzaam voor onderzoekers om vertrouwd te raken met subtiele maar belangrijke onderdelen van het protocol, zoals best practices om de steriliteit gedurende het gehele proces te bewaren en hoe men kan voorkomen dat er celdebris in het geoogste virus terechtkomt.

Efficiënte lentivirale verpakking berust op drie componenten. Ten eerste moet de lentivirale expressievector enkele van de elementen bevatten die nodig zijn voor virusverpakking en stabiele integratie, evenals elementen voor expressie van het gen van belang, zoals een short hairpin RNA, microRNA of een reportercassette.

Ten tweede moeten de lentivirale verpakkingsplasmiden de eiwitten leveren die essentieel zijn voor het verpakken van een RNA-kopie van het expressieconstruct in recombinante pseudovirale deeltjes en de daaropvolgende reverse transcriptie en virusintegratie na infectie. Ten derde moeten 2 9 3 TN-producentencellen transient worden gecotransfecteerd met de expressie- en verpakkingsvectoren. Deze cellen produceren pseudovirale deeltjes met hoge titers die uit het cultuurmedium kunnen worden geoogst.

Uiteindelijk hangt een succesvolle transductie van de doelcellen grotendeels af van het aantal virale deeltjes per cel voor een bepaald celtype. Met andere woorden, de multipliciteit van infectie; begin met het kweken van 2 9 3 TN-cellen in 15 centimeter cellenkweekplaten gedurende 18 tot 24 uur om een confluentie van 60 tot 80% te bereiken.

Op het moment van transfectie zal elke plaat ongeveer 14 miljoen cellen opleveren om de virusopbrengst te verhogen. Er kan gebruik worden gemaakt van meer dan één plaat; wanneer de 2 9 3 TN-cellen 60 tot 80% confluent zijn, zijn ze klaar voor transfectie. Voeg voor elke plaat cellen 1,6 milliliters serumvrij DMEM toe aan een 15 milliliter falcon-buis.

Voeg vervolgens 22,5 micrograms ppac H one of Ppac F1 en 4,5 micrograms van uw lenti vector Construct toe aan het DMEM en meng door herhaaldelijk te pipetteren. Voeg daarna 55 microliters pure affection toe aan dezelfde buis en vortex deze 10 seconden, gevolgd door een incubatie van 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na 15 minuten één buis toe aan elke kweekplaat.

Voeg de vloeistof druppelsgewijs toe en wals de plaat vervolgens voorzichtig, incubeer daarna de cellen gedurende 48 uur bij 37 °C met 5% CO2. Indien het lenti-vectorconstruct een fluorescent gen zoals GFP tot expressie brengt, controleer de cellen dan onder een microscoop; een succesvolle transfectie zal 50 tot meer dan 90% groene fluorescerende cellen opleveren. Verzamel nu het supernatant van de celcultuur in een conisch buisje van 50 mL. Het supernatant bevat de infectieuze pseudovirale deeltjes.

Eventuele cellen die van de plaat worden losgetrokken, hebben geen negatieve invloed op de productie van het virus. Om debris te verwijderen, wordt het virale supernatant gecentrifugeerd bij 1500 G gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Collecteer vervolgens het virale supernatant zonder de pellet te verstoren, waarbij u ervoor zorgt dat er een buffer van ongeveer 500 microliters supernatant overblijft, en ga verder naar de volgende stap, namelijk het concentreren van de virusdeeltjes 72 uur na transfectie.

Een optionele tweede collectie van het virale supernatant kan met dezelfde techniek worden uitgevoerd nadat de virale staat is verzameld. Concentreer dit door één volume ijskoude peg-virusprecipitatie-oplossing toe te voegen aan elke vier volumes supernatant in een centrifugebuis van 50 milliliter van polypropyleen. Keer de oplossing om om deze te mengen.

Gebruik nooit een vortexmixer en bewaar de oplossing vervolgens zonder agitatie bij vier graden Celsius gedurende maximaal 96 uur. Centrifugeer het mengsel na een minimale koeltijd van 12 uur gedurende 30 minuten bij 1500 G en vier graden Celsius. Na de centrifugatie zullen de geprecipiteerde lentivirale peptiden zichtbaar zijn als een beige of witte pellet onderin de buis.

Verwijder nu alle resten vloeistof door voorzichtig te aspireren, zonder de neergeslagen lentivirale particles in het pellet te verstoren. Alternatief kan het grootste deel van het supernatant worden verwijderd, waarna het pellet wordt geresuspendeerd in het resterende supernatant. Draag de suspensie vervolgens over naar een steriele eppendorfbuis van twee milliliter en centrifugeer de buis gedurende twee minuten in een koude microcentrifuge.

Pipette bij 14.000 RPM het resterende supernatant weg en resuspendeer het pellet van lentivirale partikels in ijskoude, steriele buffer op één tiende tot één honderdste van het oorspronkelijke volume. Pipetteer het pellet voorzichtig in de oplossing zonder bellen te vormen en houd het gedurende het hele proces koud. Zorg ervoor dat het pellet volledig is geresuspendeerd.

Maak tot slot aliquots van 15 tot 25 µL in steriele cryogene buisjes op ijs en bewaar de buisjes bij -70 °C. Een succesvolle verpakkingsronde levert 10 miljoen tot 1000 miljoen IFU per milliliter op voor virustransductie in een 24-wells kweekplaat, met 50.000 cellen per well, en kweek deze gedurende de nacht onder hun gespecificeerde kweekcondities. De cellen moeten een confluentie van 50 tot 70% hebben voor transductie voor titteringsdoeleinden.

HT 10 80-cellen kunnen worden gebruikt als een gemakkelijk te transduceren controlecellijn. Aspireer de volgende dag het medium van de cellen. Combineer vervolgens het cultuurmedium met de geconcentreerde duck-oplossing, zodat de uiteindelijke concentratie van trans-ducks 1x is. Voeg 0,5 mL van de transduceerde oplossing toe aan elke put met doelcellen bij de juiste dichtheid van 50 tot 70% confluentie. Voeg virus toe aan elke put in de volgende verdunningen: 1:100, 1:10 en een onverdunde 1:1 verdunning.

Het virus kan tot 72 uur in contact blijven met de doelcellen zonder het medium te vervangen. Na 72 uur zal het provirus stabiel in het genoom van de gastheer zijn geïntegreerd en het gen van belang tot expressie brengen. Indien de expressie van een aanwezige fluorescente marker kan worden gebruikt om de transductie-efficiëntie bij verschillende virusverdunningen te schatten, kan het aantal infectieuze eenheden worden gekwantificeerd via QPCR.

Zodra de virustiter bekend is, berekent u het juiste volume virus om de gewenste multiplicity of infection voor andere doelcellen te bereiken. Het meten van de titer en het beheersen van de MOI garandeert consistentie tussen experimenten en verschillende viruspreparaten. Het virus is nu klaar voor gebruik in verdere experimenten.

De startdichtheid van de 2 9 3 TN-cellen was cruciaal voor een succesvolle virale verpakking op de dag van transfectie. Deze 2 9 3 TN-cellen waren tussen de 60 en 80% confluent. 24 uur na een succesvolle transfectie met een lenti-vector die GFP tot expressie bracht, bleek dat ten minste 90% van de 2 9 3 TN-cellen groene fluorescentie vertoonde.

72 uur na transductie bleef GFP tot expressie komen in de HT 10 80 gastcellen. Dit geeft aan dat het lentivirale construct stabiel in het genoom van de gastheer is geïntegreerd; transductie van dezelfde gastcellen bij een tienvoudige verdunning leidde tot een proportionele afname van de GFP-expressie. Dit komt doordat de relatie tussen de virale titer en de lentiviraal gemedieerde genexpressie direct proportioneel is.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in vijf dagen worden uitgevoerd, met ongeveer één tot twee uur per dag indien correct uitgevoerd. Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u functioneel infectieuze virale partikels efficiënt en veilig kunt verpakken en hoe u cellen succesvol met het virus kunt transduceren. Vergeet niet dat werken met lentivirus gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen nodig zijn, zoals het werken in een BSL 2 weefselkweekkap.

Draag altijd een laboratoriumjas en handschoenen bij het uitvoeren van deze procedure.