Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila

Om reconstructies uit te voeren van ontwikkelende organen binnen de Drosophila melanogaster, moeten we het forward model bepalen dat de voortplanting van licht binnen de pop zelf het beste beschrijft. De procedure begint met het selecteren van een witte prepupa en deze vastlijmen aan het uiteinde van een capillaire buis, zodanig dat de anterieur-posterieure as van de pop parallel aan de buis is georiënteerd. Een kleine capillaire buis wordt gevuld met een fluorescerende kleurstof en in de popomhulling ingebracht.

Na zorgvuldige aanpassing van de assen wordt de pop 360 graden gedraaid. Beelden worden onder verschillende hoeken vastgelegd. De verkregen fluorescentie-transilluminatiedata worden gebruikt om het forward-model te bepalen dat zal worden ingezet om de ontwikkeling van organen in beeld te brengen.

Hoi, mijn naam is Claudia en ik ben verbonden aan het Center for Assistance Biology van het Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Ik ben Ula Petou van het Paramount Lab aan de Harvard Medical School, en ik ben Daniel Rozanski van het Institute for Biological and Medical Imaging aan de Technische Universiteit München en het Heliman Center München. Vandaag laten we u een procedure zien voor de driedimensionale reconstructie van het gehele lichaam in Oph Melano Casta.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium voor in vivo visualisatie van organen in ontwikkeling tijdens de pupilstatus. Laten we beginnen. Houd er vóór aanvang rekening mee dat er geen begeleidende video is die vóór deze video bekeken moet worden, waarin sommige technische aspecten van optische projectietomografie gedetailleerder worden uitgelegd dan hier.

Daarnaast legt de andere video de beeldvorming van geprepareerde weefsels of organen van grotere dieren uit. Voor alle in deze video behandelde experimenten zullen drosophila-transgenen worden gebruikt. Dit zijn EL A gal four, dat tot expressie komt in de speekselklieren, apteris gal four, dat tot expressie komt in de larvale precursorweefsels van de adulten-vleugel en thorax, en het transgen dat fluorescent eiwit produceert.

Als reactie op gal four genaamd U-A-S-G-F-P en white 1118, worden de niet-fluorescerende controle-mannetjes die de UAS-transgenen dragen, gekruist met maagdelijke vrouwtjes die de GAL four-transgenen dragen om weefselspecifieke expressie van GFP te bereiken. Kruisingen worden opgezet met acht tot 10 maagdelijke vrouwtjes en mannetjes op standaardvliegenmedium met een strooisel van bakkersgist. De vials worden bewaard bij 25 °C in een bevochtigde incubator onder een licht-donkercyclus van 12 uur.

Twee dagen na het begin van de kruising worden de ouders overgebracht naar een nieuw flacon en vijf tot zes dagen later zullen PUI het flacon beginnen te vullen met witte PrepU. Deze worden geselecteerd op GFP-expressie onder een fluorescente dissectiemicroscoop. Selectie van witte pre-pui garandeert een correcte stadiering van de dieren, aangezien zij ongeveer één uur wit blijven.

Na de pupillatie worden ze gepigmenteerd of bruinachtig. GFP-expresserende pupae worden voorzichtig met een natte penseel uit de vials verzameld en in een druppel water of PBS in een Petrischaal geplaatst, waarbij ze schoonveegd moeten worden om autofluorescerende materialen te verwijderen. Met behulp van de penseel zijn ze nu klaar voor tomografische beeldvorming.

Indien de PrepU verder moet rijpen om het juiste ontwikkelingsstadium te bereiken, kunnen ze in een Petrischaal met een nat velletje keukenpapier of in een schoon voedingsbuisje worden bewaard. Dit garandeert voldoende vochtigheid en een correcte ontwikkeling voor beeldvorming. De PrepU moet worden bevestigd aan de binnenzijde van een glazen capillair buisje met een diameter van 800 micron.

Smeer het posterieure uiteinde van de pupa in met secondelijm en oriënteer het gelijmde oppervlak van de prepupa in de buis, zodanig dat de anterieur-posterieure as van de vlieg parallel loopt aan de buis. Het anterieure deel van het dier zal over de capillaire buis uitsteken. De capillaire buis wordt nu op de rotatietafel van de microscoop bevestigd.

Stel in een verticale positie de kantelas van de rotatiepodia zo in dat de rotatieas van de buis parallel loopt aan de pixelkolommen van de beeldvormende CCD. Wanneer de positie van de vlieg is geoptimaliseerd, kan worden overgegaan tot beeldvorming. In dit voorbeeld worden dieren met fluorescerende speekselklieren afgebeeld; vliegen die GFP in hun speekselklieren tot expressie brengen, kunnen worden gegenereerd uit een kruising tussen EAG four- en U-A-S-G-F-P-stammen.

We beginnen met een gemonteerde prepupa; verlicht de prepupa met een excitatiestraal en verzamel het GFP-fluorescentiesignaal. Draai bij transilluminatie de PrepU 360 graden om zijn verticale as en neem de transilluminatiebeelden op. Elk beeld komt overeen met 10 graden rotatie.

De totale acquisitietijd hangt af van de hoeveelheid fluorescentie en de intensiteit van de excitatiestraal. Typische tijden liggen in de orde van één minuut. In dit voorbeeld wordt een DSO-pop die GFP tot expressie brengt in de wing imaginal discs afgebeeld.

Deze pop kan worden verzameld uit een flacon van een kruising tussen Aus GAL four en U-A-S-G-F-P stammen. De prepupa wordt gemonteerd zoals eerder beschreven. Aangezien de beeldvormingstijd voor dit experiment echter ongeveer acht uur bedraagt, is het essentieel dat de omgeving vochtig blijft en op kamertemperatuur wordt gehouden. Om dehydratie en de dood van het dier te voorkomen, wordt een sluiter over de excitatiebundel geplaatst om het doven van fluorforen in het betreffende weefsel te voorkomen, en om ervoor te zorgen dat het dier niet door de laserstraal wordt verbrand; verlicht vervolgens met de excitatiebundel en verzamel het GFP-fluorescentiesignaal via transilluminatie.

De prepupa wordt volledig rond zijn verticale as gedraaid. Tijdens de gegevensverzameling duurt de rotatie slechts één minuut en wordt deze met verschillende tijdsintervallen herhaald. Om een time-lapse serie beelden van de vleugels tijdens de ontwikkeling te maken, kunnen gegevens gedurende ten minste zes uur worden verzameld met een snelheid van 100 beelden per uur.

Het is essentieel dat de totale lichtblootstelling met dit sluiter wordt gecontroleerd om schade of fotobleken te voorkomen. Deze film toont beelden die zijn verkregen tussen de PrepU-fase en de pupil-hoefaversie. Bij het reconstrueren van het driedimensionale beeld is er sprake van een sterke voorwaartse verstrooiing die in rekening moet worden gebracht, en die niet door diffusie kan worden benaderd.

Om de reconstructie uit te voeren, moet een forward scattering-model van de lichtvoortplanting worden bepaald. Voor de eenvoud wordt absorptie verwaarloosd. De mate van verstrooiing wordt experimenteel getest. Hiervoor wordt een vreemd object met gestandaardiseerde fluorescentie ingebracht in de niet-fluorescerende witte 1118 prepupa, die vervolgens wordt gescand om de gegevens voor het forward-model te genereren. Begin met het vullen van een silica-capillaire buis van 100 micron met PS 5.5 fluorescerende kleurstof.

Duw de capillaire buis met behulp van capillaire werking onder een hoek van 45 graden ten opzichte van de anterieure as in de pop, monteer de PrepU in een capillaire buis en positioneer deze op de juiste wijze op de roterende tafel zoals eerder beschreven. Belicht de prepupa nu met een excitatie-laserstraal via een lens met een lage numerieke apertuur en verzamel fluorescentie-transilluminatiebeelden van de prepupa. Zoals eerder beschreven, wordt MATLAB-software gebruikt om de gegevens te fitten in het expliciete theoretische forward-model. Om het reconstructieproces te vergemakkelijken, is de firm e-benadering van de transportvergelijking gekozen, aangezien deze het forward-scattering-regime beschrijft en ook past bij de experimentele gegevens.

Nadat het juiste voorwaartse model is bepaald, kunnen we de speekselklieren reconstrueren en de tomografische reconstructies in timelapse verkrijgen. Als u van plan bent om vrijruimte-tomografie te gebruiken, kunnen er ook configuratie-algoritmen voor indexmatching worden ingesteld. Eerst tonen we een 3D-reconstructie van de speekselklieren in een vroeg stadium van de ontwikkeling.

Ter vergelijking laat histologische kleuring van de speekselklieren zien dat de reconstructies goed correleren met de histologie. Deze time-lapsefilm van de ontwikkeling van de vleugelimaginale schijven is verkregen van een enkel levend exemplaar. Ter vergelijking laat histologische kleuring van de vleugelschijf op dezelfde tijdstippen zien dat de reconstructies goed correleren met de histologie.

We hebben zojuist aangetoond hoe u een systeem kunt bouwen om driedimensionale structuren in vivo en in de loop van de tijd te beelden. Hiermee kunnen we de morfogenese in Drosophila volgen en de ontwikkeling van de vleugels over zes opeenvolgende uren monitoren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het cruciaal om het juiste forward-model voor lichtvoortplanting binnen Drosophila te kiezen.

Deze methode kan in combinatie met histologische technieken worden gebruikt om inzicht te krijgen in de ontwikkeling van organen tijdens de pupilstadia van de octopus, en kan worden aangepast voor de studie van verschillende organismen van vergelijkbare grootte. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.