Visualiseren van Single-molecule DNA-replicatie met fluorescentiemicroscopie

Bij deze techniek worden glazen dekglasjes gefunctionaliseerd met een mengsel van inerte en biotinyleerde peg-moleculen. Er wordt een flowcel gecreëerd met dit gefunctionaliseerde oppervlak, die vervolgens op een turf-microscoop wordt geplaatst. Biotinyleerde rolling circle-templates worden aan het oppervlak bevestigd met behulp van multivalent streptavidine.

Wanneer de substraten worden gerepliceerd door toevoeging van replizone-eiwitten en nucleotiden, wordt het resulterende dubbelstrengs DNA verlengd met laminaire stroming en in real-time afgebeeld met behulp van een intercalerende kleurstof. Hoi, ik ben Nathan Tanner van het laboratorium van Antoine Van Ian in de afdeling Biologische Chemie en Moleculaire Farmacologie aan de Harvard Medical School. Ik ben Joe Laro, ook van het Van Noian-laboratorium.

Vandaag laten we u een procedure zien voor fluorescentie-imaging van DNA-replicatie in real-time op single-molecule niveau. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de gecoördineerde DNA-syntheseactiviteiten van individuele replicatiecomplexen te bestuderen. Laten we beginnen.

Om deze procedure te starten, wordt de gebiotinyleerde staart-oligo geannealeerd aan het enkelstrengs M 13 DNA door een tienvoudig overschot aan oligo in TBS-buffer toe te voegen, te verhitten tot 65 °C en vervolgens het warmteblok uit te schakelen om langzame afkoeling mogelijk te maken voor een correcte annealing van de primer. Nu de geprimde M 13 gereed is, wordt deze toegevoegd aan een mengsel van 64 nM T7 DNA-polymerase en T7 replicatiebuffer die dNDP's en magnesiumchloride bevat, waarna de reactie 12 minuten lang bij 37 °C wordt geïncubeerd. Aan het einde van de incubatie wordt de reactie gestopt met 100 mM EDTA.

Zuiver vervolgens het gevulde product-DNA met fenol-isoamylalcohol-chloroformextractie en dialyseer dit in TE-buffer of een andere geschikte bewaarbuffer; extraheer elke organische fase opnieuw om eventuele resterende M 13 te herwinnen. Bepaal na dialyse de DNA-concentratie met een UV-Vis-spectrofotometer. Eén iteratie van de template-preparatie kan voldoende nanomolaire concentratie template opleveren voor honderden tot duizenden single-molecule-experimenten.

Nu het DNA gereed is, kan worden overgegaan tot het prepareren van de gefunctionaliseerde dekglasplaatjes. Het te repliceren DNA wordt bevestigd aan glazen dekglasplaatjes die gefunctionaliseerd zijn met Amil Lane; de Oxy-groep van de Amil bindt aan het glas, waardoor een amine beschikbaar blijft voor de binding van gebiotinyleerde peg-moleculen. Deze coating helpt om aspecifieke binding aan het oppervlak te verminderen.

Om de glazen dekglasjes grondig te reinigen, plaatst u deze in kleurpotten en vult u de potten met ethanol voor sonicatie. Sonicate gedurende 30 minuten, spoel de potten leeg en vul ze met een een molar kaliumhydroxide-oplossing. Sonicate gedurende 30 minuten en herhaal beide wasstappen. Voor de eerste functionalisatiereactie moeten alle sporen van water worden verwijderd.

Vul de kleurpotten met aceton en sonicteer gedurende 10 minuten. Leeg de potten en vul ze opnieuw met aceton. Voeg vervolgens het sine-reagens toe aan de potten en agiteer gedurende twee minuten.

Stop de reactie vervolgens door te spoelen met een grote overmaat water. Droog de dekglasjes daarna door ze 30 minuten lang bij 110 °C in de oven te bakken. Bereid vervolgens het PEG-mengsel voor met een concentratie van ongeveer 0,2% gewicht per volume; het gebruik van een glazen dekglas-afstandhouder maakt het mogelijk om de dekglasjes te scheiden. Pipetteer 100 µL op een droog gesilicatiseerd dekglasje.

Plaats een tweede dekglas bovenop. Incubeer de dekglazen gedurende drie uur in de PEG-oplossing. Scheid vervolgens elk paar dekglazen en was deze uitgebreid met water.

Zorg ervoor dat de dekglasjes met de gefunctionaliseerde zijde naar boven worden gehouden, aangezien slechts één zijde met peg wordt gecoat. Droog de dekglasjes tot slot met perslucht en bewaar ze onder vacuüm in een exsiccator; de oppervlakken blijven minstens een maand stabiel. Op deze manier kunnen tientallen dekglasjes in één batch worden gemaakt en naar behoefte worden gebruikt.

Nu de dekglasplaatjes klaar zijn, kan de flowkamer voor het single-molecule experiment worden geassembleerd. Begin hiermee door 20 tot 25 milliliter blokkeringsbuffer met BSA in een vacuümhouder te plaatsen om eventuele luchtbellen voor latere stappen te verwijderen. Verdun vervolgens 25 microliter streptavidine in 100 microliter PBS en verspreid de oplossing over het oppervlak van een PEG-gefunctionaliseerd dekglasplaatje; laat dit 20 minuten incuberen bij kamertemperatuur zodat de streptavidine kan binden aan het oppervlaktebiotine, terwijl de overige onderdelen van de kamer worden voorbereid.

Terwijl het dekglasstreeptje incubeert, snijdt u een stuk dubbelzijdige tape met een achterzijde aan beide kanten af, zodat deze overeenkomt met de afmetingen van de kwartsglaasplaat die is gebruikt om de stroomkamer te assembleren. Markeer de positie van de buisopeningen op de tape met een potlood, zodat een omtrek van de stroomkamer op de tape kan worden getekend. Maak na het markeren van de gaten een rechthoek van twee millimeter breed rondom de markeringen.

Deze rechthoek dient als stroomkanaal, dus zorg voor rechte zijden en laat ruimte over rond de in- en uitlaat van de slang. Snijd nu de gemarkeerde tape langs de getekende omtrek, waarbij u strakke, schone sneden maakt om te voorkomen dat er plakbandresten in het kanaal uitsteken. Maak de kwartsplaat grondig schoon met aceton om lijmresten van flowcelconstructies uit eerdere experimenten te verwijderen.

Bepaal de beste uitlijning van de kanaalomtrek. Verwijder één zijde van de kleefstrook en plaats de tape voorzichtig op het objectglas. Let erop dat de tape correct is uitgelijnd, aangezien de inlaat- en uitlaatgaten onbelemmerd moeten blijven.

Bereid vervolgens de stukken slang van 0,76 millimeter voor de inlaat en uitlaat van de flowcel voor. Het is raadzaam om het uiteinde van de slang onder een hoek van ongeveer 30 graden af te snijden, zodat de slang niet plat tegen de bodem van de kamer wordt gedrukt. Hang de slangen aan reageerbuisrekken om ze in de volgende stappen eenvoudig aan de flowcel te kunnen bevestigen.

De incubatie van het dekglas is nu voltooid. Spoel het met strep avid ENC gecoate dekglas grondig af met water en droog het met perslucht. Let erop dat u het dekglas niet omdraait, aangezien slechts één zijde is gefunctionaliseerd.

Voltooi ten slotte de assemblage van de stroomkamer door de andere zijde van de tapebescherming te verwijderen en de kwartsglasplaat op het dekglas te plaatsen. Druk licht op het dekglas om eventueel ingesloten lucht in de kleefstof naar buiten te duwen. Dit helpt te voorkomen dat er luchtbellen in het stroomkanaal terechtkomen.

Smeer de zijkanten van de kamer dicht met epoxy. Plaats de afgeknipte slang in de gaten van het kwarts, zet deze vast met epoxy en laat dit enkele minuten drogen. Wanneer de epoxyafdichting droog is, kan worden gestart met het blokkeren van het oppervlak.

Gebruik een naald van 21 gauge. Trek een deel van de Degas-blokkeringsbuffer door een van de buizen. Spoel een paar keer door om luchtbellen te verwijderen en laat de kamer ten minste een half uur incuberen voordat u overgaat naar het experiment voor replicatie van enkelvoudige moleculen.

Nu de flowcel is afgesloten, plaatst u deze op de microscopietafel. Zet de kamer vast met tafelklemmen en zorg ervoor dat het stroomkanaal langs de y-as is uitgelijnd. Verbind de uitlaatbuis van de flowcel met de spuitpomp met behulp van een verbindingsbuis met een grotere diameter.

Plaats de inlaat in de blokkeringsbuffer en trek de spuit terug om eventuele lucht uit de slang te verwijderen. Een voorzichtig tikje tegen de uitlaatslang helpt om eventuele luchtbellen die in de flowcel vastzitten te verwijderen. Voeg nu het DNA toe; verdun de DNA-template-stock tot 25 picomolar in één milliliter blokkeringsbuffer en laat dit met een matige stroomsnelheid, zoals 0,025 milliliters per minuut, gedurende 30 minuten door de kamer stromen om een goede oppervlaktebezetting van het DNA te verkrijgen.

Zodra het DNA zich in de kamer bevindt, wordt het overtollige DNA weggespoeld met blokkeringsbuffer-wasbeurten voor ten minste 200 flowcell-volumes. Om al het vrije DNA te verwijderen, worden de laser en de camera ingeschakeld. De gekoelde CCD moet de juiste temperatuur bereiken voordat deze gebruikt kan worden.

Nadat het overtollige DNA is weggewassen en de replicatiebuffer is ontgast, wordt het mengsel voor de replicatiereactie bereid met nucleotiden, DTT en cytoxine in de replicatiebuffer. Voeg vervolgens de eiwitten toe en meng voorzichtig. Laat het reactiemengsel vervolgens in de flowcell stromen.

De stroomsnelheid moet hier voldoende zijn om dubbelstrengs DNA uit te rekken voor een stroomkanaal van twee millimeter breed en 100 micrometer hoog. 0,04 milliliters per minuut werkt goed. Geef het mengsel ongeveer 10 minuten de tijd om de kamer binnen te stromen.

Verplaats het gezichtsveld naar de zijkant van het kanaal en stel scherp op het adhesiemateriaal om er zeker van te zijn dat men zich nabij het oppervlak bevindt voor het scherpstellen en het starten van de beeldvorming. Pas het laservermogen, de focus van de microscoop en de hoek van het turf aan. Houd het vermogen laag om fotoclieving van het gekleurde DNA te voorkomen.

Neem beelden op met een snelheid van één tot vijf frames per seconde gedurende enkele minuten, afhankelijk van de snelheid van de DNA-replicatie. Herhaal dit om langere replicatietrajecten te verkrijgen of verplaats naar een nieuw veld om meer moleculen te zien wanneer bijna het gehele reactiemengsel in de cel is gepompt; voeg meer buffer met cyt toe om andere gezichtsvelden te bekijken. Het maken van meerdere afbeeldingen van verschillende gerepliceerde moleculen levert statistieken op voor de bepaling van de productiviteit.

In de rolling circle-replicatieassay leidt de leidende strengsynthese tot de verlenging van de staart die de cirkel met het oppervlak verbindt; de staart wordt door de lagging strand-polymerase omgezet in dubbelstrengs DNA en door laminaire stroming uitgerekt, zoals getoond. Hier is een voorbeeld van een gezichtsveld met Cy3-oranje bij een excitatie van 532 nanometer.

De kleine fluorescerende vlekken zijn vastgezette, niet-gerepliceerde substraten. Let op de extreme lengte van de producten en het grote aantal producten per veld. In een typisch gezichtsveld zijn talrijke replicerende moleculen zichtbaar als groeiende heldere lijnen van gekleurd DNA. E Coli-experimenten bij 37 °C geven vijf tot 50 moleculen per veld, afhankelijk van de oppervlaktedichtheid.

De T7-replicatiezone start veel efficiënter en zal meer dan 50% van de moleculen in een veld repliceren. Met een dergelijke hoge dichtheid is het moeilijk om individuele moleculen te onderscheiden, zoals hier te zien is. Voer het T7-experiment daarom uit bij lagere eiwitconcentraties of een lagere oppervlaktedichtheid. Grafieken van typische replicerende moleculen uit E. coli- en T7-experimenten bevatten eindpunt-trajecten van moleculen uit E. coli en T7 uitgezet tegen de tijd; de trajecten zijn gefit met lineaire regressie om replicatiesnelheden te verkrijgen, die in dit voorbeeld 467,1 basenparen per seconde voor E. coli en 99,4 basenparen per seconde zijn.

Voor T7 geven de snelheidsdistributies van enkelvoudige molecuultrajecten, gefit met enkele Gaussianen, een gemiddelde van 535,5 ± 39 basenparen per seconde voor E. coli en 75,9 ± 4,8 basenparen per seconde. Voor T7 zijn de lengtedistributies van replicatieproducten gefit met een enkelvoudig exponentieel verval om de productiviteit te bepalen, welke 85,3 ± 6,1 kilobasenparen bedraagt voor E. coli en 25,3 ± 1,7 kilobasenparen voor G7. We hebben u hiermee getoond hoe gecoördineerde DNA-replicatie met enkelvoudige moleculen kan worden gemeten.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de dekglasjes correct te functionaliseren en schone, rechte stroomkanalen te maken. Zorg ervoor dat de laserstroomlaad laag blijft en minimaliseer fotoclievage van het lange DNA. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.