Directe observatie van Enzymen repliceren DNA met behulp van een Single-molecule DNA Stretching Assay

Deze video demonstreert een protocol voor het visualiseren van DNA-replicatie via widefield optische microscopie met gelineariseerd en chemisch gemodificeerd lambda-DNA. Het DNA is bevestigd aan een gefunctionaliseerd glazen dekglasje. Het vrije uiteinde van het DNA is gelabeld met een bead en het DNA wordt uitgerekt door laminaire stroming.

Wanneer de replicatie wordt geïnitieerd, begint de leidende streng te verlengen en wordt de slepende streng korter door coiling. Het grote verschil in lengte tussen dubbelstrengs en enkelstrengs DNA bij lage krachten maakt een directe observatie van DNA-conversies tijdens de replicatie mogelijk. De lengte van het DNA-construct wordt gemonitord door de positie van het kraaltje te volgen, wat een nauwkeurige bepaling van de snelheid en het proces van DNA-replicatie mogelijk maakt.

Hallo, ik ben Ari Ulrich van de laboratoria van Anto one Vanian en Charles Richardson van de afdeling Biologische Chemie en Moleculaire Farmacologie aan de Harvard Medical School. Vandaag laten we u een procedure zien voor het in beeld brengen van DNA-replicatie op enkelmoleculair niveau. Wij gebruiken deze procedure in onze laboratoria om enzymatische activiteiten te bestuderen die plaatsvinden tijdens de DNA-synthese.

Laten we beginnen. Aan het begin van deze procedure wordt gelineariseerd bacteriofaag Lambda-DNA gemodificeerd door middel van annealende oligonucleotiden om een replicatievork te vormen, bestaande uit een complementaire lambda-vorkarm, een gebiotinyleerde vorkarm en een vorkprimer. De gebiotinyleerde vorkarm bevat een biotine-label aan het 5'-uiteinde, waardoor het DNA-sjabloon aan het oppervlak van de flowcel kan worden verankerd.

Het lambda-DNA wordt verder gemodificeerd door het annexeren van een ander oligonucleotide dat een digogenine-groep bevat, die dient als een immuno-tag met hoge affiniteit voor de bevestiging van een kraal. Om de replicatievork te genereren, dient men lambda-DNA te verkrijgen samen met verschillende oligonucleotiden waarvan de sequenties in het bijbehorende geschreven protocol van deze video te vinden zijn. Deze oligonucleotiden omvatten een gebiotineerde vorkarm, een lambda-complementaire vorkarm, een vorkprimer en een lambda-complementair digogenine-uiteinde; fosforyleer vervolgens de 5'-uiteinden van de lambda-complementaire vorkarm en het lambda-complementaire digogenine-uiteinde met behulp van T4-polynucleotidekinase.

Meng vervolgens de gefosforyleerde lambda complementaire fork-arm, de gebiotinyleerde fork-arm, de fork-primer en het lambda DNA in een molaire ratio van 10 op 10 op 100 op één. Verhit het mengsel in T4 DNA-ligasebuffer gedurende vijf minuten bij 65 °C en laat het langzaam afkoelen tot kamertemperatuur door het warmteblok uit te schakelen, zodat de oligonucleotiden en T4 DNA-ligase correct kunnen annealen aan het mengsel, en incubeer dit gedurende twee uur. Bij kamertemperatuur zal T4 DNA-ligase het dichten van de nicks tussen de oligonucleotiden en het lambda DNA katalyseren.

Ligueer tenslotte het gefosforyleerde lambda-complementaire digogenine-uiteinde aan het DNA-replicatietemplate door het gefosforyleerde lambda-complementaire digogenine-uiteinde in T4-ligasebuffer toe te voegen. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 45 °C en laat het vervolgens langzaam afkoelen tot kamertemperatuur door het warmteblok uit te schakelen. Ligueer het gefosforyleerde lambda-complementaire digogenine-uiteinde aan het DNA-replicatietemplate door T4-DNA-ligase aan het mengsel toe te voegen en incubeer dit gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Het uiteindelijke DNA-replicatietemplate is nu klaar voor gebruik. Om de tassel-geactiveerde magnetische beads aan het DNA-replicatietemplate te binden, moeten deze worden gefunctionaliseerd met een FAB-fragment dat specifiek is voor digogenine.

Om dit proces te starten, resuspendeert u de voorraadoplossing van de beads en brengt u 400 µL over in een Eppendorf-buisje. Plaats het buisje in een magnetische separator en laat dit incuberen tot de oplossing helder is. Verwijder vervolgens het supernatant door middel van pipetteren. Om de tosylgroepen voor antilichaamkoppeling te activeren, voegt u één milliliter bindbuffer toe en mengt u dit voorzichtig door te pipetteren.

Verwijder opnieuw het supernatant met behulp van een magnetische separator. Voeg vervolgens 240 µL FAB-fragment toe en resuspendeer de beads in 400 µL boraatbuffer. Meng grondig en laat incuberen op een rotator gedurende 16 tot 24 uur bij 37 °C.

Scheid na incubatie de beads met behulp van de magnetische scheider en verwijder het supernatant. Was de beads met één milliliter wasbuffer en incubeer deze gedurende vijf minuten bij 4 °C; verwijder vervolgens de buffer met de magnetische scheider. Deze wasstap wordt tweemaal herhaald.

Om de vrije tosylgroepen te blokkeren, wordt één milliliter BSA in trisbuffer toegevoegd en wordt dit vier uur geïncubeerd bij 37 °C. Na incubatie wordt de buffer met een magnetische scheider van de beads verwijderd, waarna deze twee keer met buffer worden gewassen en in aliquoten worden verdeeld. Voor gebruik wordt het te repliceren DNA bevestigd aan glazen dekglasjes die zijn gefunctionaliseerd met Amil lane.

De oxygroep van de amil-lane bindt aan het glas, waardoor een amine beschikbaar blijft voor binding aan gebiotineerde peg-moleculen. Deze coating helpt om aspecifieke binding aan het oppervlak te verminderen. Om de glazen dekglasjes grondig te reinigen, plaatst u deze in kleurpotten en vult u de potten met ethanol voor sonicatie.

Spoel de potten gedurende 30 minuten uit en vul ze met een een molar potassium hydroxide oplossing; behandel dit 30 minuten lang met ultrasoon geluid en herhaal beide wasbeurten. Voor de eerste functionalisatiereactie moeten alle sporen van water worden verwijderd. Vul de kleurpotten met aceton en behandel dit 10 minuten lang met ultrasoon geluid.

Leeg de potten en vul ze opnieuw met aceton. Voeg vervolgens het sine-reagens toe aan de potten en schud gedurende twee minuten. Quench daarna met een grote overmaat water.

Droog vervolgens de dekglasjes door ze 30 minuten lang bij 110 °C in de oven te bakken. Bereid daarna het PEG-mengsel voor op ongeveer 0,2% w/v. Gebruik gebiotineerd PEG, inclusief een spacer voor het dekglasje, om de dekglasjes van elkaar te kunnen scheiden; pipetteer 100 µL op een droog gesilaniseerd dekglasje.

Plaats een tweede dekglas bovenop. Incubeer de dekglazen gedurende drie uur in de PEG-oplossing. Scheid vervolgens elk paar dekglazen en was deze uitgebreid met water.

Zorg ervoor dat de dekglasjes met de gefunctionaliseerde zijde naar boven blijven liggen, aangezien slechts één zijde met peg wordt gecoat. Droog de dekglasjes tenslotte met perslucht en bewaar ze onder vacuüm in een desiccator; de oppervlakken blijven minstens een maand stabiel. Op deze manier kunnen tientallen dekglasjes in één batch worden gemaakt en naar behoefte worden gebruikt.

Nu de dekglasjes gereed zijn, kan de stroomkamer voor het experiment met enkelvoudige moleculen worden geassembleerd. Het experiment met enkelvoudige moleculen wordt uitgevoerd met een eenvoudige stroomkamer, geconstrueerd uit een gefunctionaliseerd dekglasje, dubbelzijdige tape, een kwartsglaasje en slangjes. Voor elk experiment met enkelvoudige moleculen wordt één stroomkamer klaargemaakt.

Begin met het mengen van vijf milliliter blokkeringsbuffer en 20 milliliter werkbuffer en plaats het mengsel in een vacuümexsiccator om eventuele luchtbellen te verwijderen voor latere stappen. Verspreid vervolgens 100 microliters van een werkoplossing van strp din in PBS over het oppervlak van het met peg gefunctionaliseerde dekglasplaatje en laat dit 20 minuten incuberen bij kamertemperatuur om strp din aan het oppervlaktebiotine te laten binden. Snijd ondertussen een stuk dubbelzijdige tape op de maat van de kwartsglaasplaat en markeer de positie van de buisopeningen op de tape.

Schets de stroomkamer door een centraal kanaal van drie millimeter breed en rechthoeken die beide gaten bevatten te tekenen. Stroomkamers kunnen worden ontworpen met twee inlaat- en twee uitlaatkanalen in een Y-vorm. Snijd nu de gemarkeerde tape langs de getekende omtrek, waarbij u strakke, schone sneden maakt om er zeker van te zijn dat er geen lijmresten in het kanaal uitsteken.

Reinig de kwartsglaasplaat grondig met aceton om lijmresten van de flowcell-constructie uit vorige experimenten te verwijderen. Bepaal de beste uitlijning van de kanaalomtrek. Verwijder de beschermfolie van één zijde van de kleefband en plaats de tape voorzichtig op de kwartsglaasplaat.

Zorg ervoor dat de tape correct is uitgelijnd, aangezien de in- en uitlaatopeningen niet geblokkeerd mogen worden. Bereid vervolgens de buisstukken voor met een binnendiameter van 0,76 millimeter voor de inlaat en uitlaat van de flowcel. Snijd het uiteinde van de buis onder een hoek van ongeveer 30 graden, zodat de buis niet plat tegen de bodem van de kamer wordt gedrukt.

Hang de slangetjes aan reageerbuishouders zodat ze in de volgende stappen gemakkelijk aan de flowcel kunnen worden bevestigd. Inmiddels zou de incubatie van het dekglas voltooid moeten zijn. Spoel het dekglas grondig af met water en droog het met perslucht.

Zorg ervoor dat het dekglas niet wordt omgedraaid, aangezien slechts één zijde is gefunctionaliseerd met peg. Voltooi de assemblage van de flowkamer door de andere zijde van de tapebevestiging te verwijderen en het kwartsglasplaatje op het dekglas te plaatsen. Druk lichtjes op het dekglas om eventuele lucht die in de lijm is ingesloten naar buiten te duwen. Dit helpt te voorkomen dat er luchtbellen in het stroomkanaal terechtkomen.

Dicht de zijkanten van de kamer af met epoxy. Plaats de afgesneden slangetjes in de gaten van het kwarts en zet deze op hun plaats vast met de epoxy. Laat dit enkele minuten drogen.

Zodra het droog is, gebruikt u een naald van 21 gauge om een deel van de DGAs-blokkeringsbuffer door een van de buisjes te trekken om het oppervlak van de kamer te blokkeren. Spoel een paar keer door om luchtbellen te verwijderen en laat de kamer ten minste 30 minuten incuberen voordat u overgaat naar het experiment voor replicatie van enkelvoudige moleculen. Zodra de met DNA-template gefunctionaliseerde beads en de flowkamer zijn voorbereid, kan een experiment met enkelvoudige moleculen worden uitgevoerd.

Plaats als eerste de flowcel op de microscooptafel. Zet de kamer vast met tafelklemmen en zorg ervoor dat het flowkanaal is uitgelijnd met de CCD-camera. Verbind de eerder geconstrueerde luchtvering met de spuitenpomp en met de uitlaatbuisjes van de flowcel.

Plaats met behulp van verbindingsslangen met een grotere diameter de inlaatslangen van de flowcel in blokkeringsbuffer en trek de spuit terug om eventuele luchtbellen uit de slangen te verwijderen; tik voorzichtig tegen de uitlaatslangen om luchtbellen die in de flowcel vastzitten te verwijderen. Zodra alle luchtbellen zijn verwijderd, wordt een van de inlaatslangen afgedicht met een naald en een van de uitlaatslangen afgesloten door deze 180 graden om te buigen en vast te zetten met plakband. Verdun vóór het toevoegen van DNA aan de cel de DNA-template-stock tot 10 picomolar in één milliliter DGAs one x blokkeringsbuffer. Laat de template met een gematigde stroomsnelheid door de kamer stromen om een goede oppervlaktebedekking van het DNA te verkrijgen.

Verdun de voorraadbeadoplossing tot tussen de twee en vier keer 10⁶ beads per milliliter in één milliliter DGAs 1x blokkeringsbuffer. Vortex vervolgens het mengsel en sonicize dit gedurende 20 seconden.

Laat de verdunde bolletjesoplossing in de kamer stromen. Zodra de bolletjes zijn toegevoegd, schakelt u de stroom uit en laat u de kamer in evenwicht komen. Sluit vervolgens beide uitlaatbuisjes.

Elke wijziging aan de buisjes terwijl de kamer niet gesloten is, zal drukfluctuaties veroorzaken die een sterke kracht op de beads uitoefenen en de vastgebonden DNA-moleculen afscheuren. Plug de inlaatbuis die werd gebruikt voor het laden van de beads af met een naald met behulp van de tweede inlaatbuis. Begin met het uitgebreid wassen van de flowcell met een 1x oplossing van blokkeringsbuffer-wasvloeistof DGAs.

Tik tegen het platform om te schudden en eventuele beads die aspecifiek aan het oppervlak kleven te verwijderen om dit te controleren. De beads zijn gebonden aan het DNA. Probeer de stroomrichting te wijzigen.

Zodra de losse kraaltjes voldoende zijn verwijderd, schakelt u de doorstroming uit en laat u de kamer in evenwicht komen. Bereid een vers reactiemengsel voor met replicatie-eiwitten zoals aangegeven in het tekstprotocol. Sluit de open uitlaatbuis en schakel het inlaatreservoir over naar het vers bereide reactiemengsel.

Open de uitlaat langzaam om snelle drukveranderingen te vermijden en ga verder met de enzymatische reactie. Laat eerst de eiwitoplossing bij een matige stroomsnelheid in de kamer stromen om een efficiënte binding aan het DNA mogelijk te maken. Schakel de stroming uit en laat de kamer tot evenwicht komen.

Sluit de uitlaatbuisjes en vervang het buisje dat het reactiemengsel bevat. Spoel de kamer met het buisje met DGAs-wasbuffer om vrije eiwitten na het wassen te verwijderen. Zet vervolgens de stroming opnieuw uit en laat de kamer tot evenwicht komen.

Sluit de uitlaatbuisjes en vervang het buisje met wasbuffer. Gebruik het buisje met T7-replicatiebuffer; de T7-replicatiebuffer bevat magnesiumchloride dat de start van de replicatiereactie initieert. Gebruik een stroomsnelheid van 0,012 milliliter per minuut, wat overeenkomt met een sleepkracht van drie pico Newton op de DNA-tethers onder de in dit protocol beschreven condities.

Plaats vóór het maken van beelden een permanent zeldzame-aardemagneet boven de stroomcel om aspecifieke interacties tussen de kralen en het oppervlak te voorkomen. Positioneer een vezelverlichter onder een invalshoek tussen 10 graden en parallel aan de microscooplens nabij het gezichtsveld van de microscoop met een 10 x objectief en CCD-camera. Donkerveldverlichting wordt gebruikt om het contrast bij de focus van de kraalbeeldvorming te verhogen met behulp van een tethered bead.

Start de data-acquisitie en neem gedurende 20 tot 30 minuten op met een lage framerate. In een geslaagd experiment kunnen 100 beads gelijktijdig worden waargenomen. Het experiment moet talrijke traces opleveren die de DNA-synthese van de leidende streng vertonen.

Om de snelheden en processiviteit van DNA-ontwinding en polymerisatie te meten, moeten de precieze posities van de bolletjes worden bepaald. Fit deze posities met tweedimensionale Gaussische functies. Visualiseer het traject door de positie van het bolletje in elk frame te volgen met behulp van tracking-software.

Zet vervolgens de positie van het kraaltje uit tegen de tijd met behulp van een grafisch programma om snelheidsgegevens te verkrijgen. Pas een lineaire regressie toe op de grafieken en bereken de helling voor de processiviteit. Bepaal de totale lengte van het DNA vanaf het begin tot het einde van een verkortingsgebeurtenis.

Combineer alle individuele metingen en zet de distributies van de snelheid en productiviteit uit, waarbij de gegevens respectievelijk met Gaussische en enkelvoudige exponentiële functies worden gefit. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe de snelheid en processiviteit van DNA-replicatie op enkelmolecuulniveau kunnen worden gemeten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de kracht en bepaalde spanningen door de laminaire stroming de enzymatische activiteiten van de replicatie-eiwitten niet beïnvloeden.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.