Visualiseren Cel-cel Overdracht van hiv met behulp van TL-Klonen van HIV en Live confocale microscopie

Deze procedure maakt gebruik van live-cell imaging om de overdracht van GFP-gelabeld HIV te visualiseren over virologische synapsen tussen HIV-expresserende jerk CAT T-cellen en niet-geïnfecteerde primaire T-cellen. De cel-op-cel overdrachtassay begint met het transfecteren van jerk CAT T-cellen met HIV gag IG FP, een infectieuze fluorescente kloon van HIV-1, waarbij de getransfecteerde jerk katcellen HIV gag IG FP tot expressie brengen. Deze worden vervolgens gemengd met CMTMR-gelabelde niet-geïnfecteerde primaire T-cellen en geladen in een imagingkamer, waar de overdracht van GFP-gelabeld HIV over de virologische synaps kan worden waargenomen.

De resulterende gegevens worden geanalyseerd met behulp van software voor beeldanalyse om de details van de HIV-overdracht via virologische synapsen van T-cellen te onthullen. Hallo, mijn naam is Benjamin Dale van het laboratorium van Ben Chen in de afdeling Geneeskunde aan de Mount Sinai School of Medicine. Mijn naam is Greg McNerney van het laboratorium van Dr. Thomas Huser bij het NSF Center for Biophotonics aan het UC Davis Medical Center.

En ik ben Deanna Thompson, ook uit het laboratorium van Dr. Thomas Huser. Vandaag laten we u een procedure zien voor het visualiseren van de cel-naar-cel overdracht van HIV-1 met behulp van live confocale microscopie. In deze procedure worden Jurkat-cellen getransfecteerd met een infectieuze moleculaire kloon van HIV-1; dit mag enkel worden uitgevoerd door getraind laboratoriumpersoneel dat werkt in gecertificeerde biosafety-faciliteiten.

De hier getoonde protocol kan worden uitgevoerd in weefselkweekruimtes met bioveiligheidsniveau 2+ of 3. Het werken met infectieus HIV in beeldvormingsfaciliteiten moet zijn goedgekeurd door de lokale institutionele commissie voor bioveiligheid. Houd de jerk cat-cellen die als donorcellen worden gebruikt op een concentratie tussen 2 × 10⁵ en 8 × 10⁵ cellen per milliliter.

In de kweek van jerk cat-cellen leidt een mediaconcentratie van cellen die hoger is dan 8 x 10⁵ cellen per milliliter tot een afname van de transfectie-efficiëntie. Om de procedure te starten, transfecteer 5 x 10⁶ jerk cat-cellen met het virale plasmide HIV gag IGFP met behulp van de Amaxa Nucleofector-methode zoals beschreven in het bijbehorende geschreven protocol; laat de cellen gedurende de nacht herstellen. Perifere mononucleaire bloedcellen worden gezuiverd uit buffy coats van volbloed van mensen door middel van FICOL-dichtheidsgradiëntcentrifugatie.

De primaire CD4-positieve T-cellen worden gezuiverd uit de mononucleaire cellen van perifeer bloed door middel van negatieve selectie met behulp van een CD4-positieve T-cel isolatiekit. De negatief geselecteerde CD4-positieve T-cellen worden opgevangen uit een magnetische kolom en gekweekt in ons PMI met 10% FPS, aangevuld met 10 units per milliliter recombinant humaan IL-2. De geïsoleerde primaire CD4-positieve T-cellen kunnen ook in aliquoten worden verdeeld en worden ingevroren met behulp van cryogene vriescontainers. De vriescontainers worden gedurende minimaal drie tot vier uur in een vriezer van -70 °C geplaatst.

De cellen worden vervolgens overgebracht naar vloeibare stikstof voor langdurige bewaring. Nu de Jurkat-cellen zijn getransfecteerd en de doelwit primaire CD4-positieve T-cellen zijn geïsoleerd, kan men op de dag na de transfectie overgaan tot het reinigen en labelen van de cellen. De Jurkat-cellen brengen nu het infectieuze fluorescerende HIV-construct tot expressie.

Bij het werken met infectieuze monsters dragen wij een labjas die aan de voorzijde sluit en twee paar handschoenen. Verwijder het cellulaire debris van de getransfecteerde cellen door centrifugatie over een medium met een hoge dichtheid (Fial High Pack). Doseer eerst 1,5 milliliter Fial Pack op de bodem van een conische buis van 15 milliliter.

Bedek vervolgens voorzichtig het gradiëntmateriaal met de getransfecteerde jerk hat-cellen in een volume van vijf milliliter van ons PMI-medium. Op dit punt zijn de getransfecteerde jerk hat-cellen in staat om infectieus HIV te produceren. Daarom moeten alle pipetpuntjes die in contact komen met de HIV-expresserende cellen worden gedesinfecteerd met een 10% bleekoplossing.

Sluit de buis af met een dop en spray de buitenkant van de buis met een 70% ethanol-oplossing en veeg deze af met een droge Kimwipe voordat de buis in een container in de veiligheidskast wordt weggegooid. Centrifugeer de cellen 20 minuten bij 400 Gs op kamertemperatuur met de rem uitgeschakeld. Verwijder na centrifugatie voorzichtig de cellen van de interface tussen het medium en de pellet met een pipet en breng de cellen over naar een nieuwe conische buis van 15 milliliter. Verdun de cellen met ons PMI-medium tot een totaal volume van 15 milliliter en centrifugeer 10 minuten bij 300 Gs.

Bij kamertemperatuur suspenderen we het pellet in drie milliliter jerk hat cultuurmedium en brengen we dit over naar een putje van twee centimeter van een zes-puts plaat. Plaats de plaat in de weefselkweekincubator tot gebruik de volgende dag. Label in de avond van dezelfde dag de primaire CD4-positieve T-cellen die als doelcellen worden gebruikt, om ze te kunnen onderscheiden van de donorcellen. Pelleteer eerst 4 x 10⁶ van de primaire CD4-positieve T-cellen door te centrifugeren bij 400 G gedurende 10 minuten.

Was de cellen vervolgens met vijf milliliter PBS en resuspendeer deze in twee milliliter PBS. Voeg cell tracker orange toe tot een eindconcentratie van 1,5 micromolar en incubeer gedurende minuten bij 37 graden Celsius. Wanneer de incubatie van de cellen is voltooid, voeg acht milliliter compleet chica media toe en centrifugeer 10 minuten bij 400 Gs.

Resuspendeer de cellen in drie milliliter volledig medium aangevuld met 10 units per milliliter IL-2 en plaats deze gedurende de nacht in de weefselkweekincubator. Na de incubatie gedurende de nacht zijn de donor- en doelcellen gereed voor het cel-op-cel-transferexperiment. Bereid, voorafgaand aan het opzetten van het cel-op-cel-transferexperiment, de beeldvormingskamer voor om het platform te bufferen tegen temperatuurschommelingen in de ruimte.

Om omgevingslicht te blokkeren, wordt een groot zwart scherm over de gehele microscoopopstelling voor verhitting gedrapeerd, waardoor een geïsoleerde luchtlaag rond het systeem ontstaat. De beeldkamer wordt op een stabiele 37 °C gehouden met behulp van een thermostatische verwarming met een T-type thermokoppelpunt dat naast het monster is geplaatst voor temperatuurterugkoppeling. Voorverwarm gedurende 30 minuten voordat het monster wordt gemonteerd.

Spinning disc confocale beeldvorming met een geïnverteerde optische microscoop wordt gebruikt om 3D-confocale beelden te maken van de cel-naar-cel overdracht van HIV. Alle hardware en acquisitie, inclusief een Z-tafel, worden aangestuurd door de en of IQ versie 1.8 software; het scannen wordt uitgevoerd door een CS U 10 spinning disc confocale unit die gelijktijdig meer dan 800 confocale spots gebruikt om de scansnelheid aanzienlijk te verhogen ter ondersteuning van de snelheid. De CS U 10 is gekoppeld aan een zeer gevoelige electron multiplying charred coupled device camera om snelle beeldvorming bij weinig licht mogelijk te maken, wat zowel fotobleken als fototoxiciteit vermindert.

De fluorescentielichtbron is een argon-krypton iongaslaser met meerdere golflengten. Een akosto-optisch instelbaar filter (AOTF) wordt gebruikt om de gewenste golflengten te selecteren, in dit geval 488 nanometer en 568 nanometer, terwijl het vermogen wordt geregeld om fotobleken verder te verminderen en de beeldvormingstijd te verlengen. De AOTF sluit de laser snel af na elke belichting van 15 tot 30 milliseconde wanneer de camera geen beelden vastlegt, waardoor onnodige blootstelling wordt voorkomen terwijl de beelden van de EMCCD-camera naar de computer worden overgedragen.

Het laserlicht wordt in het spinning disc-systeem geïntegreerd met behulp van een 405 488 568 647 quad-band dichroïsche spiegel; de fluorescentie-emissie wordt op basis van golflengte gescheiden met behulp van een 560 nanometer long-pass dichroïsche spiegel met een image splitter. Het groene kanaal wordt gefilterd met een 525/50 nanometer band-pass filter en het rode kanaal wordt gefilterd met een 609/54 nanometer band-pass filter. De twee kanalen worden zij aan zij geprojecteerd op de EMCCD-camera.

Terwijl de beeldkamer opwarmt, bereidt u de cellen voor op het experiment voor cel-naar-cel transfer. Gebruik een hemocytometer om de HIV gag IGFP-expresserende ette-cellen te tellen. Plaats de hemocytometer in een petrischaal om directe blootstelling aan de virus-expresserende cellen te voorkomen.

Was de cellen met CO2-onafhankelijk medium en resuspendeer deze in medium voor live-cell imaging met een concentratie van 1 tot 3 × 10⁷ cellen per milliliter. Het gebruik van CO2-onafhankelijk medium maakt een CO2-incubatiekamer overbodig. Voor imaging.

Tel de cellen vervolgens, was ze en resuspendeer de gelabelde primaire CD4-positieve T-cellen zoals zojuist getoond voor de Jurkat-cellen. Start daarna de cel-op-celtransfer: meng 20 µL HIV gag IGFP-getransfecteerde Jurkat-cellen met 40 µL gelabelde primaire CD4-positieve T-cellen en breng 50 µL over in een gasdoorlaatbare EBD-microkamer die is behandeld voor weefselkweek. Sluit de kamer af met pluggen en bevestig de pluggen door de interface tussen de plug en de EBD-kamer te omwikkelen met parafilm.

Veeg de beeldvormingskamer af met een chemisch doekje gedrenkt in 70% ethanol en laat deze kort aan de lucht drogen in de zuurkast. Transporteer de afgesloten beeldvormingskamer in een afgesloten container om accidentele blootstelling te voorkomen. Mocht de kamer tijdens het transport vallen, dan dient men direct na het laden van de IBD-beeldvormingskamer met cellen het apparaat op de microscoop te monteren.

Maak beelden van celparen met een 60 x 1,42 NA olie-immersieobjectief, aangezien de hoge numerieke apertuur de resolutie aanzienlijk verbetert om de acquisitiesnelheid per 3D-beeldstack te maximaliseren. Kader het opnamegebied van de camera van de EM CD in op het directe gebied rondom een celpaar. Bovendien kan een grote Z-stap tussen 0,45 en 0,75 micrometers onder deze omstandigheden ook helpen de acquisitie te versnellen.

Beelden worden continu geregistreerd met intervallen van 20 tot 60 minuten. Herhaaldelijk beeldvorming van dezelfde monsterplek kan tot zes uur duren met minimale fotobleking tijdens de acquisitie. Elk datasegment bestaat uit tienduizenden beelden die in totaal vijf tot 20 gigabyte kunnen beslaan.

Om het transport en de analyse van de grote bestanden te vergemakkelijken, wordt elk bestand opgesplitst en geëxporteerd als TIFF-afbeeldingsbestandssegmenten van één gigabyte. Gebruik voor de analyse van de verkregen beelden een van de diverse beschikbare softwareprogramma's voor beeldanalyse. Raadpleeg het bijbehorende geschreven protocol voor details over de beeldanalyse, inclusief correctie voor intensiteitsverlies door bleaching en automatische en handmatige tracking van gag-puncta.

Binnen 10 tot 15 minuten na het mengen kunnen HIV gag IGFP-expresserende Jerk-katcellen worden gevisualiseerd terwijl ze hechten aan primaire CD4-positieve T-cellen. Met deze conjugaten kunnen de bewegingen van gag-puncta in geïnfecteerde cellen evenals in doelcellen worden beoordeeld. Na de synaps, binnen 30 minuten tot drie uur, kan de beweging van gag IG FP-puncta naar doelcellen die met CellTracker zijn gelabeld, worden waargenomen.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe de cel-naar-cel overdracht van HIV tussen T-cellen gevisualiseerd kan worden. Bij het uitvoeren van deze procedures is het zeer belangrijk om alle voorzorgsmaatregelen voor biosafety level two plus of biosafety level three in acht te nemen bij het hanteren van monsters die zijn blootgesteld aan HIV-expresserende cellen. Denk er daarnaast aan om goed onderhouden JCA-cellen en endotoxinevrij DNA te gebruiken om de transfectie te optimaliseren.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.