Aorta Ring Assay

Het algemene doel van de aorta-ringassay is het bieden van een flexibel experimenteel systeem waarin bloedvaten kunnen uitlopen vanuit complete stukken muis-aorta binnen een 3D-matrix. Dit wordt bereikt door eerst de thoracale aorta uit een muis te dissecteren en deze vervolgens zorgvuldig te ontdoen van alle resterende omliggende weefsels. Plakjes van de schone aorta of aorta-ringen worden geplaatst in individuele putjes van een 48-wells plaat, die elk zijn gevuld met basal matrix extract of BME in de vorm van koepels.

Een extra druppel BME sluit de ring in een 3D-structuur in. De matrix kan elk gewenst experimenteel reagens bevatten. Na incubatie gedurende enkele dagen kan worden waargenomen dat er vaten uit de aortaringen groeien, waarna het angiogene potentieel van de testverbindingen kan worden beoordeeld.

Hallo, ik ben Karen Bein van het laboratorium van Dr. E Lewis van de afdeling Klinische Biochemie aan de Beon University of the Negative in Be Sheva, Israël. Vandaag laten we u een procedure zien voor de aortaring-assay bij muizen. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de effecten van verschillende materialen op de vorming van bloedvaten te bestuderen.

Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, laat u het basale matrixextract of BME ontdooien op ijs of bij 4 °C. Zodra het ontdooid is, dient u het BME koud te houden om te voorkomen dat het opnieuw stolt.

Euthanaseer op de dag van het experiment een zes tot zeven weken oude muis middels een standaard injectie van ketamine en xylazine; voer een snelle bloedafname uit via de halsarteriën, gevolgd door cervicale dislocatie. Begin de procedure door het dier af te vegen met 70% ethanol in een steriele laminaire flow-kast. Maak vervolgens, terwijl u onder een dissectiescoop werkt, een verticale incisie in de huid met steriele pincetten en dissectiescharen en open de peritoneale wand.

De incisie moet zodanig worden gemaakt dat het bovenste deel van het borstbeen wordt blootgelegd, waarbij ook de ribbenkast wordt doorgesneden en het diafragma wordt verwijderd. Schuif vervolgens alle organen voorzichtig opzij om de thoracische aorta, die langs de wervelkolom ligt, volledig bloot te leggen. Plaats, zodra de aorta zichtbaar is, een dunne steriele pincet tussen de aorta en de wervelkolom. Spreid de pincet en til de aorta geleidelijk uit zijn bed, waarbij het thoracische segment van de rest van de aorta wordt gescheiden.

Nu de aorta is vrijgemaakt, gebruikt u een scherp schaartje om deze weg te snijden van de muis, beginnend bij het uiteinde dat zich dicht bij de niervaten bevindt en eindigend nabij het hart. Plaats de uitgenomen thoracische aorta in een Petrischaal gevuld met koud steriel PBS. Nu de aorta is verwijderd, kunnen de aortaringen worden geprepareerd met behulp van twee steriele pincetten onder een binoculair.

Maak de aorta thoracica schoon door het omringende vetweefsel te verwijderen. Zorg ervoor dat de aorta niet beschadigd raakt en houd deze alleen bij de randen vast. De aorta moet herhaaldelijk in de Petri-schaal met PBS worden ondergedompeld om uitdroging te voorkomen totdat deze volledig is schoongemaakt.

Nu de aorta thoracica schoon is, gebruikt u een scalpel en werkt u onder de binoculair om de aorta gelijkmatig in ringen van één millimeter te snijden. Gebruik een liniaal onder het snijvlak als gids en zorg ervoor dat u een nieuw mesje gebruikt en dit regelmatig vervangt om de scherpte te behouden. De uiteinden van de aorta worden niet gebruikt. Gebruik na het snijden van elke ring een pincet om deze zeer voorzichtig over te brengen naar een nieuwe schaal met koude PBS.

Plaats alle ringen in dezelfde plaat met PBS om ervoor te zorgen dat de assay gerandomiseerd is. Aangezien elk segment van de aorta een enigszins verschillend angiogeen potentieel heeft, moeten de ringen op ijs worden bewaard. Bereid vervolgens de assayplaat voor met vooraf gekoelde pipetpunten.

Voeg aan elke put van een 48-wells plaat ongeveer een druppel van 150 µL koude BME toe; de druppel stolt tot een koepel tijdens het toevoegen. De BME maakt transport van stoffen, chemotaxis van cellen en, bovenal, celdifferentiatie en migratie mogelijk, wat leidt tot de vorming van neovaten. De buitenste putten worden gevuld met PBS. Om uitdroging van de BME te voorkomen, dient de BME-druppel 20 tot 30 minuten bij 37 °C te stollen. Zodra de BME is gestold, wordt een aortaring voorzichtig met een pincet uit de petrischaal getild; om beschadiging te voorkomen, moet de ring worden overgedragen in de druppel lipide die zich tussen de pincetpunten vormt. Gebruikmakend van de oppervlaktespanning van de vloeistof, wordt één aortaring in het bovenste midden van elke koepel geplaatst en gedurende 10 minuten bij 37 °C geïncubeerd. Voeg bovenop elke ring nogmaals 150 µL BME toe en incubeer dit gedurende 20 tot 30 minuten.

Bij 37 °C is de ring nu ingekapseld in BME en assay. Materialen kunnen aan de plaat worden toegevoegd om de assay te starten. Vul vooraf bereid serumvrij medium voor menselijke endotheelcellen aan met ofwel het experimentele materiaal, ofwel een groeisupplement voor endotheelcellen als positieve controle, of een negatieve controle.

Gebruik alleen het medium. Voeg 500 µL van het supplementmedium toe aan elke put en incubeer bij 37 °C gedurende zes tot 12 dagen. Controleer de plaat tijdens deze incubatieperiode onder de microscoop op vaten die uit de aorta groeien en op geavanceerde volwassen vaten, die worden gekenmerkt door verdere vertakkende vaten.

De uitlopers uit het ringweefsel dienen driedimensionaal gefotografeerd te worden tussen dag 6 en 12 met een standaard fasecontrast-stereoscoop. Verzamel daarnaast op diverse dagen tussen dag 6 en 12 de supernatanten en bewaar deze bij 4 °C voor gebruik binnen een dag, of bewaar ze bij -20 °C of -80 °C voor later gebruik. De supernatanten kunnen worden geanalyseerd met diverse technieken, zoals ELISA voor VGF of een Griess-assay voor de nitric oxide-spiegels.

Deze beelden zijn verzameld 12 dagen na het plaatsen van de ringen in de putjes en incubatie met ofwel de cultuur, het medium (zichtbaar in de bovenste rij beelden), of ECGS, dat als positieve controle voor vaatsprouting werd gebruikt (zichtbaar in het onderste paneel). Elke afbeelding is een representatieve momentopname van vier van de 12 ringen, wat gewoonlijk per conditie in de assay wordt gebruikt.

De hoek van elke aortaring in elke afzonderlijke put is zwart. Wanneer op deze manier gefotografeerd, vertonen aortaringen die zijn blootgesteld aan ECGS vaatgroei en de pijlen wijzen naar enkele van de vele gevormde vaten. Elk vat wordt gekarakteriseerd als ketens van endotheelcellen met af en toe vertakkingen, wat aangeeft dat ze volgroeid zijn.

Er kunnen geen uitlopende vaten in de cultuur worden waargenomen. Mediumputjes in het bovenste paneel. We hebben zojuist laten zien hoe de aortische assay moet worden uitgevoerd bij deze procedure. Het is belangrijk om nauwkeurig te werken en de condities te begrijpen.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.