Gericht Cellular Self-Assembly to Cell-Derived weefsel Rings fabriceren voor Biomechanische Analyse en Tissue Engineering

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van 3D-weefselconstructen uit geaggregeerde cellen en celafgeleide matrix die gebruikt kunnen worden voor functionele analyse. Dit wordt bereikt door eerst een polycarbonaatmatrijs te frezen om ringvormige putjes met een ronde bodem te creëren. Vervolgens wordt polydimethylsiloxaan of PDMS op de polycarbonaatmatrijs gegoten om een template te vormen.

Vervolgens wordt de PDMS-sjabloon gebruikt om aros-wells te vormen. De laatste stap is het zaaien van cellen in de aros-wells om ze te laten aggregeren en cohesieve weefselringen te vormen. Uiteindelijk kan deze methode worden gebruikt om cellulaire zelfassemblage en weefselengineering met verschillende celtypen te bereiken, en maakt het analyse mogelijk van de bijdrage van cellen en cel-afgeleide extracellulaire matrix aan de weefselstructuur en -functie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere weefselkweekbenaderingen is dat we weefselconstructen volledig kunnen genereren uit cellen en de door hen geproduceerde extracellulaire matrix, sneller dan voorheen gerapporteerd, en in een formaat dat geschikt is voor mechanische analyse. Begin met het frezen van een stuk polycarbonaat van een halve inch dik om 15 ronde ringvormige putjes te creëren met een diameter van de centerpost van twee millimeter. Reinig de polycarbonaatmal om eventuele plastic resten te verwijderen die tijdens het freesproces zijn ontstaan en laat de mal drogen. Meng vervolgens PDMS in een verhouding van 10 op 1 van base en uithardingsmiddel. Ontgas de oplossing om alle luchtbellen te verwijderen en giet deze vervolgens in de polycarbonaatmal.

Ontgas vervolgens het mengsel op de mal opnieuw om resterende luchtbellen te verwijderen en hard het PDMS uit in een oven bij 60 °C gedurende vier uur; terwijl het PDMS uithardt, lost u 2% AROS op in DMEM. Verwijder na uitharding voorzichtig de PDMS-mal door deze langzaam van het polycarbonaat af te pellen, was vervolgens het PDMS met zeep en water en autoclaveer het samen met de DMEM AROS-oplossing. Plaats de geautoclaveerde PDMS-mal nu op een vlak oppervlak en vul deze met gesmolten AROS door eerst AROS in elk van de malvormen voor de centrale posten te pipetteren en vervolgens AROS in de ruimte eromheen te pipetteren.

Laat de aros ongeveer 15 minuten uitharden. Keer de mal vervolgens om om de aros uit de PDMS te halen. Snijd het overtollige aros rondom elke put weg en plaats vervolgens één aros-put in elke put van een 12-wells plaat.

Voeg celkweekmedium toe rondom de buitenkant van de aros-well, zonder de bovenkant van de well te bedekken. Plaats de platen vervolgens in de incubator om ze te laten equilibreren terwijl de cellen worden voorbereid. Trypsineer rat aortic smooth muscle cells bij 90% confluentie en resuspendeer deze.

Suspendeer de cellen op een concentratie van vijf keer 10⁶ cellen per milliliter. Pipetteer vervolgens 100 µL van de resuspendeerde cel-suspensie in elk van de geëquilibreerde aros-wells. Gebruik een cirkelvormige beweging om de cellen in elke well aan te brengen.

Plaats de platen in de incubator en laat deze 24 uur ongestoord staan. Versier het medium elke twee dagen door het medium rond de well af te zuigen en vervolgens elke well bij te vullen totdat de aros-mal volledig is ondergedompeld. Vul aan het einde van de cultuur een klein petrischaaltje met PBS.

Verwijder elke ring uit de aros-vorm door deze over de bovenkant van de middenpaal te schuiven. Plaats de ringen in de Petrischalen met PBS Center, waarbij één ring onder het digitale beeldvormingssysteem wordt geplaatst. Gebruik software voor randdetectie om de dikte van de ring op vier posities te meten: boven, onder, links en rechts langs de omtrek.

Voor het uitvoeren van eenuniaxiale trekproef. Bevestig een ringmonster aan twee dunne draadklemmen. Rek de klemmen uit totdat er een scheurlast van vijf milli Newton op de ring wordt uitgeoefend.

Voer vervolgens de dwarsdoorsnede in die is berekend uit de diktemetingen en noteer de meetlengte. Voer acht pre-cycli uit op de ring tussen de scheurlast en 50 kilo pascal. Zet de ring na de achtste pre-cyclus bloot aan een rek met een snelheid van 10 millimeters per minuut tot aan het punt van breuk bij 10 millimeters per minuut.

Meet voor elke ring de uiteindelijke trekspanning en de breukrek, en bereken de maximale raaklijnmodulus op basis van de verkregen gegevens. Naast functionele in vitro studies kunnen deze ringen van levende cellen ook fuseren om weefselbuisjes te vormen. Gebruik een chirurgische schaar om de uiteinden van de siliconenbuisjes schuin af te knippen zodat er schuine randen ontstaan, en autoclaveer vervolgens de siliconenbuisjes.

Vul een Petrischaal met medium, breng de gesteriliseerde op maat gemaakte siliconen buishouders over naar een veiligheidskast en plaats deze in een lege Petrischaal. Verwijder vervolgens de ringen uit de aros-wells en plaats deze in de Petrischaal die met medium is gevuld. Plaats de siliconen buisjes in dezelfde Petrischaal om ze voor gebruik te bevochtigen.

Gebruik een pincet om de punt van een siliconen slang in het midden van een ring te plaatsen en schuif de ring voorzichtig over de siliconen slang. Schuif de ringen tegen elkaar aan door ze achtereenvolgens voorzichtig in beide richtingen langs de slang te duwen. Nadat de ringen zijn gemonteerd, worden de siliconen slangen in de polycarbonaathouders uitgelijnd en worden de twee delen van de houder op elkaar geschroefd.

Voeg 55 milliliters medium toe aan de Petrischaal. Vervang het medium elke drie dagen gedurende de gehele kweekperiode om de weefselbuisjes te verwijderen. Vul eerst een Petrischaal met PBS.

Verwijder vervolgens de siliconen buisjes uit de houder van polycarbonaat en gebruik een pincet om de weefselbuisjes van het siliconen buisje af te schuiven en in de schaal te plaatsen. Wanneer dit correct wordt uitgevoerd, bezinken de cellen op de bodem van de aros-wells en trekken ze zich binnen 24 uur na plaatsing samen om een weefselring rond de centrale paal in de Agarro s-well te vormen. Dit is een representatieve grafiek van een spannings-rekcurve, verkregen uit een uniaxialle trekproef van een twee millimeter grote weefselring gegenereerd uit gladde spiercellen van ratten. De uiteindelijke treksterkte, de maximale trekmodulus en de waarden voor de breukrek worden vervolgens gebruikt om de mechanische eigenschappen van weefselringmonsters te vergelijken die onder verschillende kweekparameters zijn gegroeid.

De mechanische eigenschappen van weefselringen kunnen worden gecontroleerd door kweekparameters aan te passen, waaronder het aantal geplaatste cellen, de kweekduur, het kweekmedium en het gebruikte celtype. Naast gladde spiercellen van ratten vormen primaire menselijke gladde spiercellen weefselringen met een vergelijkbare treksterkte.

Menselijke mesenchymale stamcellen aggregeren ook om ringen te vormen, maar deze waren niet sterk genoeg voor mechanische tests. Ons systeem maakt de fabricage van engineered weefselconstructen volledig uit cellen mogelijk, simpelweg door cellen in onze op maat gemaakte aros-wells te zaaien. Zodra de initiële polycarbonaatmatrijs is gefreesd, kunnen we een onbeperkt aantal PDMS-templates maken die vervolgens gebruikt kunnen worden om de matrijzen te vervaardigen, waardoor er geen extra apparatuur nodig is.

Het systeem is veelzijdig, aangezien we een aantal verschillende celtypen in het systeem hebben gebruikt om weefselringen te maken; dit systeem zou daarom potentieel kunnen worden ingezet voor zowel toepassingen in tissue engineering als voor in vitro studies naar de bijdragen van cellen en de extracellulaire matrix aan de weefselstructuur en -functie.