Digitale Microfluidics voor Geautomatiseerde Proteoom verwerking

Klinische proteomics is een belangrijke nieuwe discipline die veelbelovend is voor de ontdekking van biomarkers die nuttig zullen zijn voor de vroege diagnose en prognose van ziekten. Hier rapporteren wij een nieuwe methode voor digitale microfluidics (DMF) die verschillende verwerkingsstappen integreert die worden gebruikt in de klinische proteomics, waaronder proteïne-extractie, resolubilisatie, reductie, alkylering en enzymatische digestie. DMF maakt gebruik van discrete microdruppels van monsterproteïnen op een array van elektroden en kan bij kamertemperatuur worden uitgevoerd, wat parallelle geautomatiseerde analyse van monsters mogelijk maakt.

Deze methodologie vormt een aanzienlijke vooruitgang ten opzichte van conventionele methoden en heeft het potentieel om een nuttig nieuw instrument in de klinische proteomica te worden. Hallo, ik ben Steve Sche van het laboratorium van professor Erin Wheeler van de afdeling Chemie en het Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering aan de Universiteit van Toronto. Hallo, ik ben Gabriel van het Wheeler Lab aan de Universiteit van Toronto.

En ik ben Vivian Luke, ook van het Wearer-lab aan de Universiteit van Toronto. Ik ben Erin Wheeler. Ik heb het geluk dat ik met Steve Mace en Vivian mag werken.

Vandaag laten we u een procedure zien voor proteomische verwerking met behulp van digitale microfluidica. In ons laboratorium gebruiken we deze procedure om eiwitten en biologische monsters te bestuderen. Laten we beginnen.

Start de procedure in de zuurkast door de glazen substraten te reinigen in Piranha-oplossing. Bij het dragen van adequate bescherming: de Piranha-oplossing bestaat uit een mengsel van geconcentreerd zwavelzuur en 30% waterstofperoxide in een verhouding van drie op één. Er dient daarom voorzichtig te worden gewerkt met deze oplossing.

Incubeer de glazen substraten gedurende 10 minuten in piranha-oplossing en spoel ze na het reinigen af met gedeïoniseerd water, waarna de substraten worden gedroogd met stikstofgas. Plaats de substraten in de elektronenstraalevaporatiekamer voor de depositie van chroom tot een dikte van 250 nanometers. Verwijder de substraten uit de kamer zodra deze dikte is bereikt en spoel ze af met isopropanol, waarna ze gedurende vijf minuten op een warmteplaat bij 115 °C worden gedroogd.

Prepare de gedroogde substraten met hexamethyldisilazaan of HMDS door middel van spin-coating gedurende 30 seconden. Voer opnieuw spin-coating uit bij 3000 RPM met Shipley S 1811 fotolak met gebruik van identieke parameters.

Voorbak het substraat direct op een warmteplaat bij 100 °C gedurende enkele minuten. Pattern vervolgens de fotoresist door blootstelling aan ultraviolette of UV-bestraling gedurende vijf seconden door een fotomasker. Ontwikkel daarna de UV-belichte substraten in Shipley MF 3 21 developer, voldoende om het substraat gedurende drie minuten volledig onder te dompelen.

Spoel het substraat daarna af met DI-water. Bak het direct op een warmteplaat bij 100 °C gedurende één minuut. Ets het blootgestelde chroom door de substraten 30 seconden onder te dompelen in net genoeg chroometsmiddel om ze volledig te bedekken.

Spoel de substraten met DI-water en dompel ze 10 minuten onder in een Z 300 T stripper in een hoeveelheid die voldoende is om het substraat volledig te onderdompelen. Dit dient om de resterende fotolak te verwijderen. Spoel vervolgens met DI-water en droog met stikstofgas.

Na deze depositie wordt een isolerend polymeer van twee tot vijf micrometer Paraline C via chemische dampdepositie op het substraat aangebracht. Deponeer vervolgens 50 nanometer Teflon AF om het oppervlak hydrofoob te maken door middel van spincoating van een oplossing van 1% gewichtsprocent in fluorinert FC 40 op het substraat bij 2000 RPM gedurende 60 seconden.

Herhaal dit met een onbehandeld indiumtinoxide- of ITO-glassubstraat om de bovenplaat te maken. Bak beide substraten op een warmteplaat bij 160 °C gedurende 10 minuten om het digitale microfluïdische apparaat te voltooien.

Verwijder polymeercoatings van de contactpads van een onderste substraat door te schrapen met een scalpel. Koppel de blootgestelde pads van het onderste substraat aan 40-pins connectoren en zet een computer aan waarop LabVIEW wordt uitgevoerd. We maken gebruik van een zelfgebouwde regelkast die relais bevat met signalen die via een d-pad worden aangestuurd.

De computerbesturingskast maakt het mogelijk voor de gebruiker om signalen van 100 volts RMS per 18 kilohertz via de 40-pins connectoren op het apparaat aan te brengen. Schakel daarnaast een functiegenerator en versterker in. Assembleer het apparaat door twee stukken dubbelzijdige tape met een totale dikte van 140 micrometer op de randen van het onderste substraat te plaatsen.

Pipetteer 4 µL gedestilleerd water in een van de reservoirs en sluit het apparaat af door de niet-gepatroneerde indiumtinoxide-dia bovenop het apparaat te plaatsen, met de Teflon-gecoate zijde naar beneden gericht. Bevestig een aardingsconnector aan de bovenplaat. Voer het in LabVIEW ontwikkelde initialisatieprogramma uit om de feedbackregeling te kalibreren; het apparaat is nu gereed voor experimenten.

In dit protocol gebruiken we runder-serumalbumine of BSA als eiwitmonster om ons ontwerp en het gebruik van digitale microfluidica te demonstreren. BSA is verdund in werkbuffer of WB, bestaande uit 100 millimolar tris HCL pH 7.8 met 0.08%onic F1 27 gewicht per volume. Bereid één milliliter van elk monster en reagensoplossing en markeer het reservoir waarin deze zullen worden toegevoegd.

Verwijder na de bereiding van de reagentia de bovenplaat van het apparaat en pipetteer vier µL van de oplossing in het toegewezen reservoir. Plaats na het vullen van de reservoirs de bovenplaat terug op het apparaat. Gebruik het interne LabView-programma om de volgende stappen uit te voeren.

Onthoud dat de computerinterface de gebruiker in staat stelt om druppels van ongeveer 600 nanoliter uit reservoirs te dispenseren en deze druppels op de elektrode-array te manipuleren. Dispenseer eerst een druppel van het eiwitbevattende monster uit R één en een druppel precipitant uit R twee. Voeg de twee druppels samen en laat de gecombineerde druppel vijf minuten incuberen, zodat de eiwitten op het oppervlak neerslaan.

Verplaats het supernatant weg van het neergeslagen eiwit naar het afvalreservoir. Om het neergeslagen eiwit te wassen, voegt u drie druppels wasbuffer uit R vier toe en drijft u deze over het neergeslagen eiwit naar het afvalreservoir. Laat het precipitaat drogen en voeg een druppel resolubiliseringsbuffer uit R vijf toe aan het eiwit.

Laat de buffer 20 minuten incuberen totdat het neerslag is opgelost. Dispenseer vervolgens een druppel reduceermiddel uit R zes en voeg deze samen met de monsterdruppel. Meng de gecombineerde druppel door deze in een circulair patroon over zes elektroden te bewegen.

Laat de druppel één uur incuberen bij kamertemperatuur. Breng een druppel alkyleringsmiddel uit R zeven aan en voeg deze samen met de monsterdruppel, gevolgd door mengen. Laat de druppel 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.

Dispenseer ten slotte een druppel trypsine uit R acht en voeg deze samen met de monsterdruppel, gevolgd door menging. Laat de druppel drie uur incuberen bij 37 °C in een Petrischaal op een warmteplaat. Om de reactie te beëindigen, verwijdert u de bovenplaat en stopt u de digestie door middel van pipetteren.

Breng 0,6 mL 2,5% trichloorazijnzuur in water aan op de reactiedruppel. Zuiver het gestopte reactieproduct door de monsterdruppel direct vanaf de bodemplaat op te zuigen. Met behulp van een C 18 zip tip, volgens de instructies van de fabrikant, kunnen de monsters nu naar behoefte worden verdund en geëvalueerd via massaspectrometrie om de eiwitten in het monster met dit systeem te identificeren.

Vervolgens werden met massaspectrometrie eiwitten geïdentificeerd met waarschijnlijkheidsscores van minder dan 1 × 10⁻³, wat overeenkomt met een betrouwbaarheidsinterval van 99,9% en sequentiedekkingen van ten minste 30%. Hieruit volgt dat DMF een zeer nuttige methodologie is voor geautomatiseerde proteomische monsterverwerking. We hebben vandaag aangetoond hoe we digitale microfluidiek gebruiken om eiwitten op een geautomatiseerde wijze te extraheren en te verwerken. Deze methodologie biedt een potentiële oplossing voor monsterverlies en contaminatie tijdens de isolatie en identificatie van eiwitten.

We hopen deze methode in de toekomst toe te passen op andere biologische toepassingen, waaronder immunoassays en celgebaseerde assays. Bij het uitvoeren van dit type experiment is het belangrijkste om te onthouden het ervan te genieten. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.