High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform
23 augustus 2012
We een microfluïdische benadering voor de expressie van eiwit arrays. De inrichting bestaat uit duizenden reactiekamers gecontroleerd door micro-mechanische kleppen. De microfluïdische apparaat is gekoppeld aan een microarray-gedrukte gen bibliotheek. Deze genen worden vervolgens getranscribeerd en getranslateerd on-chip, resulterend in een eiwit array klaar voor experimenteel gebruik.
Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een modulaire eiwitarray die geen zuiveringsstap vereist, waardoor deze compatibel is met elke eiwitbibliotheek. Dit wordt bereikt door eerst synthetische genen te genereren via assemblage-PCR. Vervolgens worden de synthetische genen op epoxy-dia's geplaatst in een array.
Gebruik PDMS met siliconen controle- en stroommallen om het microfluïdische apparaat te vervaardigen. Vervolgens wordt het microfluïdische apparaat uitgelijnd met de gespotte DNA-array. Ten slotte wordt konijnreticulocytlysaat door het microfluïdische apparaat geleid en worden de eiwitten tot expressie gebracht.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die de expressie van duizenden eiwitten aantonen via fluorescerende antilichaamlabeling. Er zijn verschillende voordelen aan het gebruik van de microfluidische techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals eiwit-microarrays. Wij maken een microarray van DNA en gebruiken vervolgens cellis om eiwitten op het apparaat te produceren.
Hierdoor is eiwitzuivering niet vereist en drogen de eiwitten nooit uit. Ze blijven gedurende het gehele experiment vers. De microfluïdische techniek biedt bovendien een hogere gevoeligheid. Om het microfluïdische apparaat te vervaardigen, worden de siliconen mallen voor de besturing en de stroming 10 minuten blootgesteld aan chloortrimethylsilaandamp om de lossing van het elastomeer te bevorderen.
Bereid na de bakstappen een mengsel van siliconenelastomeer en uithardingsmiddel voor in twee verschillende verhoudingen van vijf op één en 20 op één voor respectievelijk de controlematrijs en de stroommatrijs. Giet de PDMS in de verhouding vijf op één op de controllaag. Ontgas de controllaag en bak deze 30 minuten bij 80 °C.
Breng vervolgens het PDMS-mengsel (20:1) via spincoating aan op de stroomlaag bij 2.600 RPM gedurende 60 seconden, en bak dit daarna 30 minuten bij 80 °C. Scheid de controllaag langzaam van de mal, waarbij u er goed op let dat het SU-8-patroon niet wordt afgepeld. Snijd vervolgens met een scalpel het device langs de omtrek uit en gebruik onder een microscoop een stompe naald om gaatjes te prikken voor toegang tot de controlekanalen.
Lijn de stroom- en controllagenen handmatig uit, beginnend bij de linkerbovenhoek, en positioneer de drukknopklep op de controllelaag in het midden van de reactiekamer. Lijn vervolgens de eerste rij uit en laat de controllelaag voorzichtig rij voor rij los. Zorg ervoor dat alle drukknopkleppen zich in het midden van de reactiekamers bevinden en dat de adres- en invoerkleppen de stroomkanalen op de juiste positie kruisen.
Herhaal dit proces lokaal totdat alle rijen zijn uitgelijnd. Wanneer alles volledig is uitgelijnd, wordt de spanning in de PDMS opgeheven door deze voorzichtig bij de zijkanten en hoeken op te tillen. Bak het apparaat vervolgens gedurende twee uur bij 80 °C.
Snijd langs de rand en pel het tweelaagse apparaat van de ponsgaten van de stroomvorm om toegang te krijgen tot de stroomkanalen voor het genereren van DNA-constructen voor het apparaat. Voer PCR uit om synthetische genen te produceren bestaande uit een T7-promotor, een ribosoombindingsplaats, een open leesraam met verschillende epitope-tags aan beide uiteinden en een T7-terminator. Bereid een mengsel van polyethyleenglycol en D-triose-dihydraat om de synthetische genen klaar te maken voor het arrayen. Doseer 2 µL per reactie in de putjes van een 384-wells plaat.
Wellplaat. Voeg de synthetische genen toe aan een 384-wellplaat. Voeg vervolgens gedestilleerd water toe tot een eindvolume van 20 µL.
Gebruik vervolgens een microarray-spot om een reeks synthetische genen op met epoxy gecoate glazen substraten aan te brengen. Lijn het microfluïdische apparaat onder een stereomicroscoop handmatig uit met de genarray, waarbij de DNA-spot in het midden van de DNA-kamers wordt geplaatst. Lijn daarna de rest van de rijen uit.
Sluit af met een fijne afstemming van het gehele apparaat om eventuele spanning op de PDMS te verminderen en te garanderen dat het goed aan de microarray hecht. Til het lokaal op. Bond vervolgens het apparaat aan het glazen objectglas door het gedurende de nacht te incuberen op een warmteplaat bij 80 °C.
Voedselkleurstoffen worden in dit gedeelte gebruikt voor visualisatiedoeleinden. De kleppen in de controllaag worden vanuit de computer aangestuurd met behulp van LabVIEW. Het LabVIEW-script regelt een reeks solenoid-microkleppen via een elektronische controlebox.
Het magneetventielblok is aangesloten op perslucht, die de luchtstroom en druk naar de regelkleppen op het apparaat regelt. Verbind het apparaat met het magneetventielblok met behulp van een flexibele plastic slang met een binnendiameter van 0,02 inches en een roestvrijstalen pin. Vul de slangen met dubbel gedistilleerd water en steek de pin in de toegangsgaten van de regelset.
Zorg ervoor dat elke buis is verbonden met het overeenkomstige controlekanaal. Om de controlekanalen te activeren, start u de LabVIEW-applicatie, stelt u de luchtdruk in op 5 psi en brengt u vervolgens luchtdruk aan door de klep via het LabVIEW-script te activeren. Hierdoor wordt water in de PDMS-controlekanalen geperst om eventuele crosstalk tussen controlekanalen van defecte apparaten te identificeren.
Vul eerst de sandwich- en adreskleppen. Wanneer alle regelkanalen en kleppen gevuld zijn met water, worden de kleppen geprimed om de stroomkanalen eronder te blokkeren. Dit gebeurt door eerst de luchtdruk te verhogen naar 15 PSI en vervolgens via het LabVIEW-programma door middel van een reeks aan/uit-schakelaars die zijn verbonden met individuele magneetventielen.
Activeer alle ventielen door alle schakelaars in te schakelen om er zeker van te zijn dat alle ventielen openstaan. Sluit een slang aan op een van de flow-ingangen en laat lucht met een druk van 4 tot 5 PSI in het apparaat stromen. Dit zal eventuele klevende ventielen van het glazen objectglas losmaken.
Het apparaat is nu voorbereid en klaar voor visualisatie. Gele voedingskleurstof wordt gebruikt om de reagentia in deze sectie te visualiseren en de kleurloze oplossing representeert de hippies. Om de zelfassemblage van een eiwitarray op het oppervlak te faciliteren en aspecifieke adsorptie binnen het microfluïdische apparaat te voorkomen, wordt het oppervlak chemisch gemodificeerd door eerst een nieuwe slang met de benodigde oplossing aan een van de stroomkanalen in het apparaat te koppelen. Verbind vervolgens de vrije zijde van de slang met het handmatige manifold en open de luchtdrukstroom.
Breng 40 µL biotine-geëlutteerde BSA aan in een nieuwe buis en laat ongeveer de helft hiervan gedurende 20 minuten door het apparaat stromen. Gebruik 50 mM HEPES om tussen elke stap eventueel niet-reactief substraat weg te wassen. Laat vervolgens 25 µL streptavidine gedurende 20 minuten doorstromen.
Was bovenop de biotinyleerde BSA met HEPES gedurende vijf minuten om het oppervlak rond de knop te reinigen, sluit het knopventiel en laat de rest van de biotinyleerde BSA doorstromen, en was vervolgens opnieuw vijf minuten met HEPES. Om tot slot een anti-Hiss-tag array onder de knop te creëren, open het knopventiel en laat 30 µL Penta-Hiss-biotine gedurende 20 minuten doorstromen om een array van proteïnen op het device te vormen. Open de nekventielen en laat konijnenreticulocyten doorstromen.
Voeg de gekoppelde transcriptie- en translatie-reactieoplossing via het apparaat toe aan de DNA-kamer. Sluit vervolgens de sandwichkleppen om elk gen van zijn omgeving te scheiden en incubeer het apparaat gedurende 2,5 uur bij 30 °C op een warmteplaat. Label daarna het C-terminus van de eiwitten met C mix SI drie antilichaam.
Gebruik tenslotte een microarray-scanner met een 532 nanometer laser en een 575 nanometer emissiefilter. Bepaal de eiwitniveaus. Deze figuur toont de variërende niveaus van eiwitexpressie op een eiwitarray.
Gewoonlijk slaagt 20% van een genenbibliotheek er niet in om tot detecteerbare niveaus tot expressie te komen. Achtergrondniveaus werden bepaald met behulp van kamers waarin geen DNA was gespot. De signalen uit de overeenkomstige proteïnekamers zijn dus het gevolg van ruis of aspecifieke absorptie van de labelende antilichamen.
Wanneer dit correct wordt uitgevoerd, duurt de verificatie van het apparaat vier uur en het experiment met de chip vijf uur.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een microfluïdische benadering voor de expressie van eiwitarrays, waarbij gebruik wordt gemaakt van een apparaat met duizenden reactiekamers die worden aangestuurd door micromechanische kleppen. De integratie van een microarray-geprinte genbibliotheek maakt transcriptie en translatie op de chip mogelijk, wat resulteert in een direct bruikbare eiwitarray.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Microfluïdica
- Proteïne-expressie
- Genbibliotheken
Achtergrond
- Proteïne-arrays zijn essentieel voor diverse biologische assays.
- Traditionele methoden vereisen vaak zuiveringsstappen, wat de compatibiliteit beperkt.
- Microfluïdische apparaten kunnen het proces van proteïne-expressie stroomlijnen.
- Assembly PCR wordt gebruikt om synthetische genen voor array-vorming te genereren.
Doel van de studie
- Om een modulaire proteïne-array te creëren zonder zuiveringsstappen.
- Om de compatibiliteit met elke proteïnebibliotheek te verbeteren.
- Om de efficiëntie van proteïne-expressie met behulp van microfluidics te verhogen.
Gebruikte methoden
- Genereren van synthetische genen via assemblage-PCR.
- Aanbrengen van synthetische genen in arrays op epoxyplaatjes.
- Fabricage van een microfluïdisch apparaat met behulp van PDMS.
- Invoeren van konijnenreticulocytenlysaat in het apparaat voor eiwitexpressie.
Belangrijkste resultaten
- Een functioneel microfluïdisch apparaat is met succes ontwikkeld.
- Eiwitten werden on-chip tot expressie gebracht zonder zuivering.
- De methode bleek compatibel met verschillende eiwitbibliotheken.
- On-chip transcriptie en translatie zijn effectief gerealiseerd.
Conclusies
- Deze microfluïdische benadering vereenvoudigt het creëren van proteïne-arrays.
- Het elimineert de noodzaak voor zuivering, wat de bruikbaarheid vergroot.
- De techniek kan worden toegepast op diverse proteïne-bibliotheken voor onderzoek.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit microfluidische platform voor eiwitexpressie maakt de high-throughput generatie van functionele eiwitarrays mogelijk zonder zuivering, waardoor een belangrijk knelpunt bij targetvalidatie en interactiescreening wordt weggenomen. Door eiwitten in een natuurlijke, niet-gedenatureerde staat op de chip te behouden, ondersteunt de methode de betrouwbare detectie van eiwit-eiwit-, eiwit-DNA- en eiwit-RNA-interacties. Deze capaciteit verhoogt het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door het aantal fout-negatieven als gevolg van eiwitverlies of misvouwing tijdens de zuivering te verminderen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door full-length eiwitten te tot expressie te brengen met een correcte vouwing en posttranslationele modificaties.
- Operationele waarde: Elimineert zuiveringsstappen, waardoor monsterverlies wordt verminderd en de doorvoer voor grootschalige library-screening wordt verhoogd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door kwantitatieve expressiegegevens voor duizenden varianten in parallel te leveren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde proteïne-arrays rechtstreeks vanuit DNA-templates, wat batch-to-batch consistentie waarborgt voor reproduceerbare interactie-assays.
- Operationele waarde: Integreert gen-arraying en proteïne-expressie op één enkel microfluïdisch device, waardoor de handmatige verwerkingstijd en het risico op kruiscontaminatie worden geminimaliseerd.
- Assay-gereedheid: Produceert kwantificeerbare fluorescente read-outs die compatibel zijn met microarray-scanners voor interactie-mapping met een hoge dichtheid.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt snelle profilering van eiwitinteracties mogelijk over ziekterelevante targets die zijn geïdentificeerd in upstream omics-studies.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt screening op autoantilichamen of therapeutische bindingsgebeurtenissen met behulp van patiëntafgeleide monsters op arrays van tot expressie gebrachte antigenen.
- Preklinische risicovermindering: Maakt een vroege beoordeling van off-target binding of kruisreactiviteitsprofielen mogelijk voordat kandidaten verder worden ontwikkeld.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van de voorbereiding van synthetische genbibliotheken tot interactiescreening, waardoor een naadloze overgang van doelwitidentificatie naar lead-validatie mogelijk is.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door arrayed genen te tot expressie te brengen om functionele proteïneactiviteit te beoordelen zonder zuiveringsbias.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, verse proteïne-arrays die direct klaar zijn voor gebruik in biochemische of biofysische interactie-assays.
- Analytics: Biedt kwantitatieve fluorescentiegebaseerde read-outs waarmee expressieniveaus en bindingsaffiniteiten over duizenden condities kunnen worden vergeleken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt genetische varianten met functionele proteïne-outputs, waardoor correlatie met fenotypische of klinische gegevens mogelijk is.
- Enterprise hergebruik: Het microfluïdische platform kan worden hergeprogrammeerd met nieuwe DNA-arrays, wat iteratieve screeningscampagnes over meerdere projecten ondersteunt.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targetvalidatie door eiwitten in hun natuurlijke toestand tot expressie te brengen, waardoor artefacten door zuivering of denaturatie worden verminderd.
- Operationele waarde: Maakt parallelle verwerking van duizenden reacties mogelijk in een compacte opstelling, wat de efficiëntie van reagentia en de doorvoersnelheid verbetert.
- Strategische waarde: Versnelt go/no-go-beslissingen door snel interactiegegevens te genereren voor grote variantenbibliotheken.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van uitgebreide interactieprofielen en expressietrouw.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de fabricage van microfluïdische apparaten, inclusief PDMS-gieten en de uitlijning van lagen.
- Afhankelijk van toegang tot microarray-spottingapparatuur voor het genereren van DNA-arrays en microfluïdische controlesystemen (bijv. LabVIEW met magneetventielen).
- Noodzaak van gestandaardiseerde protocollen voor de preparatie van genbibliotheken, inclusief assemblage-PCR en epitope-tagging voor detectie.
- Omvat optimalisatie van incubatietijden en reagensconcentraties (bijv. konijnenreticulocytenlysaat, gebiotineerde reagentia) voor specifieke doelen van proteïne-expressie.
- Beperkt door de toegankelijkheid van faciliteiten voor microfluïdische fabricage en de technische vaardigheid die vereist is voor precieze uitlijning en bonding van lagen.
