Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP's) op de menselijke pre-mRNA

Om de bindingsplaatsen van ribonucleoproteïnen op pre-mRNA's in kaart te brengen, begint u met het betegelen van het aangewezen gebied van het betreffende pre-mRNA in vensters van 30 nucleotiden en synthetiseert u de betegelde oligos op een array. De oligos worden van de array gekookt en gecoprecipiteerd met een RNP van belang. De totale startpool wordt gelabeld met SCI drie en de gebonden pool wordt gelabeld met SCI vijf, waarna beide op de detectie-array worden aangebracht.

De array wordt vervolgens gescand en de software voor kenmerkextractie wordt gebruikt om de resultaten te interpreteren.Zouten. Hallo, ik ben Kate Watkins uit het laboratorium van Will Fairbrother van de afdeling MCB aan de Brown University. Vandaag laat ik u een snelle en goedkope procedure zien voor het bepalen van de exacte locatie van een RNA-eiwitcomplex op prem RA in het lab, waarbij prem A wordt resynthetiseerd als een pool van overlappende oligonucleotiden.

Deze pool kan vervolgens door middel van co-immunoprecipitatie worden gescheiden in een gebonden en een ongebonden fractie, om daarna met een microarray te worden geanalyseerd. Hoewel deze procedure vele toepassingen heeft, gebruiken wij deze om meerdere splicingfactoren en hun rol bij alternatieve splicing te bestuderen. Laten we beginnen.

Om deze procedure te starten, gebruikt u de uc SC genoombrowser om specifieke genen, splice-overgangen of andere gebieden van belang te downloaden waaruit de prem A-pool kan worden ontworpen. Selecteer de vensters van belang en betegel deze vervolgens computationeel met een readlengte van 30 nucleotiden en een overlap van 20 nucleotiden, zodat elke oligo 10 nucleotiden ten opzichte van de vorige is verschoven. Nu de oligo's van 30 nucleotiden lang zijn gedefinieerd, flankeert u elke oligo met universele primersequenties.

Stuur de oligos naar Agilent voor printen op een custom oligonucleotide microarray. Zodra de microarray arriveert, begint u met het terugwinnen van de DNA-oligos van het oppervlak door het dekglas van de array in een array-hybridisatiekamer te plaatsen en voorzichtig 500 microliters gedeïoniseerd water op het glas te pipetteren. Plaats de microarray-dia met de voorkant naar beneden op het dekglas, zodat de labels op beide glazen naar elkaar toe gericht zijn, en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan die het proces van het terugwinnen van de oligos kunnen verstoren.

Sluit de hybridisatiekamer en roteer deze gedurende de nacht bij 99 °C in een hybridisatieoven. Verwijder de volgende dag voorzichtig de array uit de kamer en zuig het water af, dat nu de oligos bevat die van het array-oppervlak zijn vrijgekomen. Plaats de verzameling vrijgekomen oligos in een eppendorfbuisje van 1,5 ml en soniceer deze om eventuele klonters op te breken bij 50% amplitude, drie keer met pulsen van drie tot vijf seconden per keer. Amplificeer vervolgens de verzameling via low-cycle PCR met behulp van universele primers waaraan aan het uiteinde een T-promotor is toegevoegd.

Het aantal benodigde cycli kan variëren afhankelijk van de efficiëntie van het herstel van de oligo's. Vermijd overamplificatie, wat zichtbaar is als een uitgesmeerde band op een acrylamidegel. Gebruik tot slot de mega short script kit van Amon om RNA te transcriberen.

Beëindig de transcriptiereactie door RNA-extractie met fenylchloroform, gevolgd door ethanolprecipitatie met behulp van natriumacetaat en glyco blue als carrier. Resuspendeer het RNA-pellet in 105 µL TE-buffer om de concentratie van het RNA nauwkeurig te bepalen.

Gebruik ribo green om een standaardcurve te genereren. Meet vervolgens met een fluorescentieplaatlezer. De RNA-pool is nu gereed voor co-immunoprecipitatie om de pull-down te starten.

Bereid eerst de magnetische kralen voor door proteïne A- en proteïne G-dynabeads in een verhouding van één-op-één te combineren tot een eindvolume van 50 µL per reactie. Concentreer de kralen op één plek met behulp van een magnetisch scheidingsrek om het supernatant te verwijderen. Was vervolgens twee keer met een gelijk volume koud 1x PBS; voer na de tweede wasbeurt de volgende stap uit.

Resuspendeer de beads in een gelijk volume koud 1x PBS en voeg twee nanogram van het antilichaam toe. Deze hoeveelheid kan variëren afhankelijk van het antilichaam, dus experimenten kunnen nodig zijn om de optimale omstandigheden te vinden voor het binden van het antilichaam aan de beads. Incubeer het mengsel overnacht bij 4 °C op een roteerplatform.

Voeg 's ochtends twee µg gesoniceerd totaal gist-RNA per reactie toe om aspecifieke binding te blokkeren en roteer dit nog 30 minuten bij 4 °C. Zodra de blokkeringsstap is voltooid, wordt het supernatant opnieuw met het magnetische rek verwijderd. Was de beads vervolgens twee keer met koud 1X PBS en laat het PBS van de tweede wasbeurt in de buis. Aliquoteer 50 µL van het beadmengsel in nieuwe buisjes.

Eén buis voor elke co-IP-reactie. De beads zijn nu klaar voor de co-IP. Bereid vervolgens de mastermix door de RNA-oligo-pool te combineren met het nucleaire celextract.

Neem als RNP-bron een aliquot van 50 µL van de mastermix als totale monsterbescherming. Primers, welke RNA-versies van de universele primers zijn, kunnen worden toegevoegd om eiwitbinding aan de primersequentie te voorkomen of het ontstaan van secundaire structuren in het RNA tegen te gaan. Om de co-immunoprecipitatie te starten, wordt het supernatant uit de bead-aliquots verwijderd en worden de beads opnieuw gesuspendeerd in 120 µL van de resterende mastermix. Laat de reacties één tot twee uur schudden bij 4 °C.

Aan het einde van de incubatie kan een kleine hoeveelheid eluaat, inclusief de kraaltjes, uit elke co-ip worden verwijderd. Voor aanvullende tests van de bindingsefficiëntie of specificiteit plaatst u de rest van de reacties op de magneet en verwijdert u het supernatant. Volg dit op met één tot twee wasbeurten met koude one XPDS.

Het RNA dat via het RNP aan het antilichaam op de beads is gebonden, is het IP-monster. Resuspendeer de IP-beads in 50 µL 1% SDS in 0,1 XTE-buffer en verhit de monsters 15 minuten bij 65 °C. Om het RNA te elueren, verwijdert u het supernatant, dat nu het RNA bevat dat voorheen aan de beads was gebonden; reinig dit vervolgens door fenol-chloroformextractie, gevolgd door ethanolprecipitatie, en resuspendeer het pellet in 50 µL 0,1 XT-buffer.

Voer vervolgens reverse transcriptie uit op de monsters met behulp van de reverse universele primers. Amplificeer de monsters daarna via PCR met de universele primers, waarvan er één een T7-promotor moet bevatten. Het aantal cycli dat nodig is om de pool te amplificeren, is afhankelijk van de efficiëntie van de co-IP.

Transcribeer de monsters opnieuw met de mega shorts script kit van Ambion, maar voeg dit keer twee µL amino-allele UTP toe in plaats van de T7 UTP die bij de kit is geleverd. De amino-allele UTP zal later worden gebruikt om het RNA te labelen met de side eyes. Wanneer de transcriptie is voltooid.

Fenol-chloroformextract en ethanol precipiteren de monsters. Gebruik geen glyco blue of ammoniumacetaat, aangezien deze de hybridisatie van de monsters met de array kunnen verstoren. Resuspendeer het pellet in 4,5 µL 0,1 M natriumcarbonaat.

Voeg eerst 2,5 µL nucleasevrij water toe aan het totale monster om de monsters te labelen. Voeg drie microliter S3 toe en voeg drie microliter SCI vijf toe aan het IP-monster. Incubeer gedurende één uur in het donker.

Beëindig de reactie bij kamertemperatuur door zes µL van vier M hydroxylamine HCL aan elk monster toe te voegen, meng grondig en centrifugeer. Incubeer kort gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en zuiver de gelabelde monsters via fenylchloroformextractie, gevolgd door ethanolprecipitatie. Het grootste deel van de kleur wordt samen met de vrije nucleotiden in de organische fase getrokken, waardoor de pellets mogelijk niet zichtbaar gekleurd zijn.

Resuspendeer elk pellet in 50 µL 0,1 XTE. Volg de instructies van de Agilent array-hybridisatiekit om het microarray-monster voor te bereiden, met de volgende uitzondering: fragmenteer het RNA niet. Voeg direct na het toevoegen van de fragmentatiebuffer de hybridisatiebuffer toe om de fragmentatie te stoppen.

Plaats de monsters op de array en hybridiseer gedurende drie uur bij 50 °C terwijl de array roteert. Bereid de volgende oplossingen van 50 ml voor in conische buizen van 50 ml: één buis met 2× SC-buffer, twee buizen met 1× SC-buffer en één buis met gedeïoniseerd water.

Na de incubatie van drie uur wordt de array-slide-sandwich voorzichtig losgeklamd en geplaatst in de twee XSSC-buffer. Scheid de array vervolgens voorzichtig van het dekglas met behulp van een pincet.

Verwijder voorzichtig het dekglas, waarbij u er op let het array niet aan te raken. Terwijl het glas wordt uitgetrokken, sluit u de conische buis en keert u deze voorzichtig gedurende 60 seconden om. Verplaats het array met de pincet naar de one XSSC-oplossing.

Sluit de buis af en keer deze gedurende één minuut voorzichtig om. Breng de array vervolgens over naar de tweede 1XSSC-oplossing en keer deze opnieuw voorzichtig gedurende één minuut om. Breng de array tot slot over naar de buis met gedeïoniseerd water en keer deze gedurende 30 seconden voorzichtig om.

Droog de array door de randen van het objectglas op een kim wipe te plaatsen. Blijf de array op de wipe draaien, waarbij u er zorg voor draagt dat de zijde met de oligos niet wordt verstoord. Plaats de array in een lege conische buis en ga over tot het scannen van de array.

Ga over tot het scannen van de array. Hier is een representatieve array. Elk kenmerk of oligo is gekleurd in het groen voor de totale niet-verrijkte pool of in het rood voor de IP-verrijkte pool.

Het signaal bij elk kenmerk wordt genormaliseerd ten opzichte van de totale intensiteit van dat kanaal. De uiteindelijke output is de log-ratio van het rode kanaal ten opzichte van het groene kanaal. Voor elk kenmerk op de array wordt de gemiddelde score bij elke genomische coördinaat toegewezen aan de gegeven locatie.

Een illustratie van deze middelingsstap wordt gegeven voor drie overlappende oligo's van 30 nucleotiden met scores van twee, vier en 0,5, waarbij de gemiddelde verrijkingsscore voor elk venster van 10 nucleotiden wordt weergegeven. Hier is een voorbeeld van een bindingsschema voor het polyperine-bindende eiwit PTB bij het CLTA-gen; genkenmerken zijn onderaan weergegeven en de log-gemiddelde verrijkingsscores voor de PTP-gebonden S worden weergegeven door donkerrode verticale balken. Lichtrode balken tonen gebieden die niet verrijkt zijn voor PTP-binding.

Ik heb u zojuist laten zien hoe u snel en efficiënt een oligonucleotidepool kunt maken die regio's van belang bestrijkt, zoals alternatief gesplicte exonen. Wij analyseren onze pools via microarray, maar het is ook mogelijk om ze te sequensen via Illumina, Lexi sequencing of meer traditionele Sanger-sequencing. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de creatie van de pool aanpassingen toelaat, zowel op RNA- als op eiwitniveau.

Op RNA-niveau kunnen we autologe regio's, ziekte-mutaties, polymorfismen of willekeurige mutaties introduceren in de oligonucleotidevolgorde. Op eiwitniveau kan de RNA-bindende factor worden gemodificeerd door fosforylering of andere post-translationele modificaties. Daarnaast kan de bindingsomgeving worden gemanipuleerd om de niveaus van aanvullende factoren te verhogen of te verlagen, die ofwel concurreren met ofwel interageren met het betreffende RNA-bindende eiwit.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.