Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip

Het doel van deze video is om de methode voor de isolatie en identificatie van RNA's en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïnecomplexen uit celextracten te demonstreren met behulp van immunoprecipitatiemethoden. Hallo, mijn naam is Garrett Dom en ik ben een promovendus bij de afdeling Moleculaire Microbiologie en Immunologie aan de University of Missouri, waar ik onderzoek doe onder begeleiding van Dr. Eli sso. Door de vooruitgang in high-throughput sequencing en efficiënte microarray-analyse is globale genexpressie en -analyse een eenvoudige en gemakkelijk toegankelijke vorm van gegevensverzameling geworden in veel onderzoeks- en ziektemodellen.

Echter, de steady-state niveaus van het mRNA van het doelgen correleren niet altijd direct met de steady-state eiwitniveaus. Post-transcriptionele genregulatie is een waarschijnlijke verklaring voor de divergentie tussen deze twee, aangestuurd door de interacties van RNA-bindende eiwitten.

Post-transcriptionele regulatie beïnvloedt de lokalisatie, stabiliteit en translatie van mRNA door het vormen van een ribonucleoproteïnecomplex met doel-mRNA's. Het identificeren van deze onbekende de novo mRNA-doelen uit cellulaire extracten binnen dit complex is essentieel voor het begrijpen van de mechanismen en functies van het RNA-bindend eiwit en het daaruit voortvloeiende effect op de eiwitproductie. Dit protocol beschrijft een methode genaamd ribonucleoproteïne-immunoprecipitatie, of RIP, waarmee specifieke mRNA's die geassocieerd zijn in het ribonucleoproteïnecomplex kunnen worden geïdentificeerd.

Voordat u met het experiment begint, is het essentieel dat alle reagentia, containers en benodigdheden aanwezig zijn. Behandel glaswerk om het RNase-vrij te maken met een RNase-remmer zoals RNA ZAP van Ambion, gevolgd door spoelen met DEPC-behandeld water; zorg ervoor dat alle reagentia zijn bevestigd als RNase-vrij. De eerste stap van de procedure is het oogsten van het ribonucleoproteïnecomplex uit het cellysaat; oogst exponentieel groeiende weefselcellen om tussen de 2 mg en 5 mg totaal eiwit per gebruikt monster te produceren, waarbij gewoonlijk twee P150-kweekschalen volstaan.

Hier oogsten we de menselijke borstkankercellijnen MB 2 31 en MC seven en onderzoeken we de ribonucleïne-interacties van het RNA-bindende eiwit. Het is belangrijk om op te merken dat voor elk onderzocht RNA-bindend eiwit het totale aantal cellen en de eiwithoeveelheden geoptimaliseerd moeten worden om de passende interacties tussen het doel-mRNA en het RNA-bindende eiwit te maximaliseren. Pelleteer de cellen via centrifugatie bij 1000 RPM gedurende ongeveer 8 tot 10 minuten bij 4 °C en was vervolgens drie keer met ijskoud PBS. Tik na de laatste wasbeurt voorzichtig tegen de onderkant van de buis en resuspendeer de celpellet in gelijke volumes van de bereide polysomale lysisbuffer met RNase- en protease-remmers.

Het wordt aanbevolen om het exacte volume van het celpellet af te meten, het mengsel voorzichtig te pipetteren om celklonten te verbreken en het lysaat vijf minuten op ijs te incuberen. Centrifugeer 20 minuten bij 13 000 G en 4 °C om het lysaat te zuiveren van debris; breng het geklaarde supernatant onmiddellijk over in voorkoelde RNAse-vrije microcentrifugebuisjes, houd deze op ijs en bewaar ze bij -80 °C.

Dit lysaat kan tot zes maanden worden bewaard bij -80 °C. Vermijd herhaalde vries-dooi-cycli, omdat dit kan leiden tot degradatie van eiwitten en/of mRNA. Het is aanbevolen om de IP direct uit te voeren.

Bepaal snel de eiwitconcentratie van het lysaat met behulp van een standaard Bradford-eiwitassay. Vervolgens moeten de materialen worden voorbereid voor de isolatie van ons specifieke doeleiwit. Laat het eiwit eerst voorswellen.

Incubeer de Sphero-beads een nacht in NT2-buffer aangevuld met 5% BSA bij 4 °C. Gebruik NT2-buffer in een verhouding van 4:1 met PAS-beads. Langdurige bewaring tot enkele maanden bij 4 °C is mogelijk.

Wanneer er voorafgaand aan gebruik wordt aangevuld met 0,1% natriumazide, dient het overtollige NT2-buffer te worden verwijderd zodat de uiteindelijke verhouding tussen beads en buffer één-op-één is. Gebruik RNA-vrije microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter, verwijder 100 microliters SRO speed slurry en voeg 30 microgrammen antilichaam toe voor elke individuele IP-reactie. In ons experiment gebruiken we bijvoorbeeld een who are-antilichaam, wat een muis IgG1-antilichaam is.

Daarom is onze controle-antilichaam ook een IgG1. Voeg vervolgens 100 tot 200 µL NT2-buffer toe aan het mengsel van antilichamen en beads. Daarnaast dient een isotype-gematcht antilichaam of normaal volledig serum van dezelfde soort parallel te worden gebruikt als antilichaamcontrole tegen achtergrond-RNA.

Voeg het juiste antilichaam toe aan het kraalmengsel en incubeer dit een nacht onder endTime-rotatie bij vier graden Celsius. Bereid de met antilichamen gecoate kralen vlak voor gebruik door ze vijf keer te wassen met één milliliter ijskoud NT twee buffer; was de kralen door centrifugatie bij 13.000 G gedurende één tot twee minuten bij vier graden. Verwijder het supernatant voorzichtig met een handpipetteur of aspirator.

Deze wasstap helpt om ongebonden antilichamen en RNA-contaminanten uit het antilichaamenmengsel te verwijderen. Zodra de laatste wasbeurt is voltooid, worden de beads opnieuw gesuspendeerd in 700 µL ijskoude NT2-buffer, gevolgd door behandeling met diverse RNA-remmers om de doel-mRNAs te beschermen, waaronder 10 µL RNase-out, 10 µL 100 mM DTT en 15 µL EDTA. Vul het volume aan tot 900 µL met NT2-buffer.

Vervolgens zullen we het doelcomplex immunoprecipiteren. We raden ten zeerste aan om een pre-clear stap uit te voeren om het achtergrondsignaal in uw RNA-analyse na de RIP-procedure te verminderen; pre-clear met 15 micrograms isotype controle gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Voeg 50 microliters vooraf gezwollen PAS-beads toe die niet zijn gecoat met antilichamen.

Incubeer 30 minuten bij 4 °C met rotatie en centrifugeer vervolgens bij 10.000 G bij 4 °C. Centrifugeer tot een pellet is gevormd. Bewaar het supernatant voor IP.

Voeg vervolgens 100 µL van het geïsoleerde, geklaarde lysaat met ongeveer twee tot vijf mg eiwit toe aan de bereide antilichaammix. Het verdunnen van het lysaat helpt om de achtergrondruis te verminderen; sluit de buis af met parafilm om een goede afsluiting te garanderen en incubeer vier uur lang bij 4 °C onder rollende beweging. Pellet vervolgens de beads door centrifugatie bij 5.000 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C en bewaar het supernatant voor eventuele analyse door dit, zoals eerder beschreven, op te slaan bij -80 °C. Was de beads vijf keer met 1 mL ijskoude TNT-buffer gevolgd door centrifugatie.

Verwijder vervolgens het supernatant met een handpipetteur of een aspirator. Om de achtergrondruis te verminderen, kunnen stringentere methoden worden toegepast door de NT twee-buffer aan te vullen met natriumdeoxycolaat, ureum of SDS. Houd de monsters zoveel mogelijk op ijs en werk snel om degradatie van het doel-mRNA te minimaliseren.

Ten slotte gebruiken we DNase- en proteinase K-behandelingen gevolgd door RNA-precipitatie om de ribonucleoproteïne-RNA's te isoleren; resuspendeer de kralen na het wassen in 100 µL N NT 2-buffer aangevuld met 5 µL RNAse-vrije DNase I. Bewaar de monsters gedurende 5 tot 10 minuten bij 37 °C. Voeg 1 mL N NT 2-buffer toe en centrifugeer bij 5.000 ×g gedurende vijf minuten.

Verwijder de supernatant na het centrifugeren, resuspendeer de SRO-pellet in 100 µL NT2-buffer met 5 µL proteinase K (10 mg/mL) en 1 µL 10% SDS. Incubeer het geresuspendeerde kralenmengsel gedurende 30 minuten in een waterbad van 55 °C, waarbij elke 10 minuten voorzichtig wordt getikt. Proteinase K helpt bij het vrijmaken van de ribonucleoproteïnecomponenten. Centrifugeer de kralen tot een pellet.

Centrifugeer 5 minuten bij 5 000 G bij kamertemperatuur en verzamel de supernatant, die een volume van ongeveer 100 µL zou moeten hebben. Voeg vervolgens 200 µL NT2-buffer toe aan de beads en centrifugeer 2 minuten bij 5 000 G. Verzamel ongeveer 200 µL van de supernatant en gooi de beads weg.

Combineer de supernatant en voeg 300 µL van de zure fenollagen toe en vortex. Eén minuut op kamertemperatuur en centrifugeer op maximale snelheid bij kamertemperatuur gedurende één minuut. Verzamel 250 µL van de bovenlaag.

Zorg ervoor dat de interface niet wordt verstoord, omdat dit tot contaminatie zal leiden. Voeg aan het RNA-monster 25 µL natriumacetaat bij een pH van 5,2, 625 µL gekoelde, 100% ethanol en 5 µL glyco blue mix toe. Meng goed en bewaar dit gedurende de nacht bij -20 °C.

Om bovendien een goede terugwinning van RNA te garanderen, wordt glyco blue toegevoegd; dit dient als dragermolecuul om de zichtbaarheid van de RNA-pellet de volgende dag te vergroten. Meng de buisjes door deze drie tot vijf keer om te keren, centrifugeer vervolgens op 12.000 G bij 4 °C gedurende 30 minuten en verwijder de supernatant. Voeg 1 mL gekoelde 70% ethanol toe aan de blauwe pellet en meng door omkering of vortexen, gevolgd door centrifugatie.

Centrifuge het monster bij 12, 000 G gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en centrifugeer opnieuw bij 12, 000 G gedurende één minuut bij vier graden Celsius. Verwijder eventueel resterend 70% ethanol met een pipet en laat het pellet aan de lucht drogen.

Laat vijf minuten lang op kamertemperatuur komen. Los opnieuw op in 20 tot 40 µL RNAse- en DNA-vrij water. Het monster is nu klaar voor kwantificering via NanoDrop-spectrometrie en verdere downstream-toepassingen, zoals kwantitatieve real-time PCR of microarray-analyse. Na RNA-isolatie werden microarray- en kwantitatieve real-time PCR uitgevoerd om de mRNA-targets van het RNA-bindende eiwit who are te onthullen, evenals de daaruit voortvloeiende verrijking vanuit de immunoprecipitatie.

Bevestiging via western blot onthult een zuivere isolatie van who are proteïnen. Kwantitatieve PCR demonstreert de verrijkingsfactor van het mRNA-doelwit beta actin in vergelijking met IgG one controles. Hoewel microarray-analyse unieke genetische profielen onthult tussen MC seven en MB 2 31, borstkanker-cellijnen, is ribonucleoproteïne-immunoprecipitatie door onze groep, evenals door vele andere onderzoeksgroepen, gevestigd als een uitstekend instrument om de interacties tussen RNA-bindende proteïnen en hun mRNA-doelwitten te isoleren en te bestuderen; hoewel de procedure inherent gevoelig is, zal een correcte uitvoering leiden tot de isolatie van deze ribonucleoproteïnecomplexen, die tot voor kort ontoegankelijk waren voor ontdekking en analyse.