Een Multi-parametrische Islet Perifusion System binnen een Microfluïdische Perifusion Device

In deze presentatie introduceren we een op microfluïdica gebaseerd perfusiesysteem voor eilandjes van Langerhans voor de gelijktijdige meting van dynamische insulinesecretie, calciuminstroom en veranderingen in het mitochondriële potentieel van pancreaseilandjes als reactie op insulinesecretagoga. Het perfusiesysteem bestaat uit een microfluïdisch apparaat van drie lagen, spuitpompen en een fractiecollector. Door secretagoga geïnduceerde calciuminstroom en mitochondriële potentialen worden gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoopopstelling.

Hoi, mijn naam is Ola, een onderzoeker uit het laboratorium van Dr. Val Holter van de afdeling Transplantatiechirurgie aan de Universiteit van Illinois in Chicago. Hoi, ik ben Don Lee, ook uit het laboratorium van Dr. Holter. Hoi, ik ben Tricia Hart, ook uit het laboratorium van Dr. Holter.

Vandaag tonen we u een procedure voor gelijktijdige beeldvorming van het ooglid met behulp van een lineaire glucosegradiënt. We hebben deze procedure in ons laboratorium gebruikt om de visuele aspecten en de functie van het ooglid te bestuderen. Laten we beginnen.

Het microfluïdische apparaat dat voor deze procedure wordt gebruikt, is samengesteld uit drie lagen uitgehard PDMS, geproduceerd via standaard fotolithografie. De eerste laag, vervaardigd vanuit een siliconen master, bevat de putjes van het microfluïdische apparaat die de oogjes voorzichtig op hun plaats houden, met een diepte van 150 micrometers en een diameter van 500 micrometers. De tweede laag bevat kanalen met een hoogte van 500 micrometers en een breedte van twee millimeters.

Het midden van het kanaal is verbreed om de stroming te verspreiden voor een betere uitwisseling van de oplossing. In het apparaat wordt een uitwisselingsputje gemaakt door een gat van drie millimeter hoog en zeven millimeter breed in het midden van de laag te ponsen. De derde laag is een dikke plaat PDMS. Om deze laag voor te bereiden, ponst u aan beide zijden kleine gaten die uitlijnen met de inlaat en uitlaat van het kanaal.

Op de tweede laag, zodra alle drie de lagen zijn gegenereerd, wordt de eerste laag aan een glazen objectglas gebonden met de putjes naar boven gericht. De tweede laag wordt vervolgens aan de eerste laag gebonden met de kanaalafstand naar boven. Ten slotte wordt de derde laag aan de tweede laag gebonden.

Zodra de lagen zijn verbonden, is het apparaat klaar voor gebruik in experimenten. Steriliseer het microfluïdische apparaat door 70% ethanol door de kanalen van het apparaat te laten stromen, met behulp van een spuit van 10 milliliter gevuld met 70% ethanol en verbonden met de inlaatpoort van het apparaat via Tygon-slangen. Laat vervolgens, met dezelfde opstelling, gedeïoniseerd water stromen om de ethanol uit te spoelen.

Zodra het apparaat is gesteriliseerd, plaatst u het op een verwarmde microscooptafel met behulp van tigon-slangen en verbindt u de spuitpompen die de oplossingen met hoge en lage glucoseconcentraties bevatten met een Y-connector. Sluit deze vervolgens aan op de inlaat van het microfluïdische apparaat. Verbind de uitlaat van het microfluïdische apparaat met een fractiecollector.

Zorg ervoor dat de slang op een warmteplaat van 37 °C rust. Het is zeer belangrijk om de oplossingen gedurende het gehele experiment op fysiologische temperatuur te houden. Gebruik vervolgens het LabVIEW-programma om de glucosegradiënt te initialiseren die tijdens het experiment door het microfluïdische netwerk zal worden geperfuseerd.

Deze software varieert de stroomsnelheid van twee glucoseoplossingen. Door de spuitpompen te regelen, kunnen hier verschillende glucosegradiëntprofielen worden gecreëerd: lineaire, klokvormige en vierkante glucosegradiëntprofielen. In dit experiment worden de resultaten getoond in vergelijking met de berekende verwachte waarden; hierbij zal een lineaire gradiënt van 2 mM tot 25 mM glucose worden gebruikt met een variërende stroomsnelheid van 0,01 mL/min van de twee glucoseoplossingen en een constante stroomsnelheid van 0,25 mL/min die het apparaat binnenkomt nadat de oplossingen zijn gemengd.

Zodra het juiste gradiëntprofiel is geselecteerd, moet de stabiliteit van de gradiënt worden getest. Start eerst het gradiëntensysteem. Start vervolgens de fractiecollector en verzamel perfusaat in Eppendorf-buisjes van één milliliter.

Test vervolgens met een glucometer de glucoseconcentratie in elke buis met behulp van Excel. Analyseer de resultaten die met de glucometer zijn verkregen. Vervang daarna de spuit met hoge glucoseconcentratie door een spuit met 0,5%BSA-oplossing in Krebs-Ringer-buffer en perfuseer 50 milliliters door het apparaat met een snelheid van één milliliter per minuut.

Dit voorkomt aspecifieke adsorptie van insuline aan de wanden van het microkanaal om de nauwkeurigheid te waarborgen bij het later meten van de uitgescheiden insulinewaarden na perfusie met BSA. Vervang dit door de hoge glucose-oplossing reus. Suspendeer 25 tot 30 handmatig geselecteerde muis-eyelets in een 2 mM glucose Krebs-Ringer-buffer die de calciumindicator-kleurstof fira 2:00 AM en de mitochondriale potentiaal-indicator-kleurstof rumine 1 2 3 bevat, en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.

Koppel na incubatie het apparaat los van het perfusiesysteem en laad de eilandjes voorzichtig in het microfluïdische apparaat door de tip van de pipet, met daarin de eilandjes, in de inlaatpoort te plaatsen en de eilandjes langzaam te dispenseren. Sluit het apparaat na het laden opnieuw aan op het perfusiesysteem. Let er hierbij op dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd. Start vervolgens de spuitpomp om de eilandjes te perfunderen met KRB dat 2 mM glucose bevat.

In deze stap wordt de overtollige kleurstof uit het medium gewassen, en worden de excitatie- en emissiefiltersets en de belichtingstijden bepaald die tijdens het experiment worden gebruikt. Stel vervolgens de fractiecollector in om op intervallen van één minuut te verzamelen, terwijl de oogleden worden behandeld met de lage glucoseloplossing. Gebruik de tool voor het interessegebied (ROI) van de eenvoudige PCI-beeldvormingssoftware om de gebieden of oogleden te definiëren die u wilt fotograferen.

Omcirkel daarnaast het achtergrondgebied dat zal worden afgetrokken nadat de cellen 10 minuten zijn gewassen, start de fractiecollector voor de glucosegradiënt en begin met de time-lapse imaging. Zet na 30 minuten de software en de spuitpomp voor hoge glucose uit. Ga door met perfusie met lage glucose om het effect van de hoge glucose uit te spoelen.

Stop na 10 minuten de stroom van lage glucose door de spuitpomp uit te schakelen. Exporteer na de perfusie de gegevens naar Excel voor analyse. De hoeveelheid insuline die in het perfusaat is uitgescheiden, kan worden bepaald met een ELISA voor muis-eilanden.

Er werd geperfuseerd met een lineaire gradiënt van twee tot 25 millimolair glucose, zoals hier wordt getoond. Calciuminstroom en insulinesecretie worden getriggerd na ongeveer 13 minuten perfusie, wat overeenkomt met zes millimolair glucose. Veranderingen in mitochondriële potentialen zijn eerder zichtbaar, zoals verwacht rond 11 minuten.

Deze gegevens tonen het voordeel aan van het gebruik van dit microfluïdische netwerk om de fysiologie van de oogjes te karakteriseren. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe ons microfluïdische parafusie-apparaat kan worden gebruikt voor de studie van de oogjesfysiologie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in het apparaat zitten, aangezien dit ertoe kan leiden dat de oogjes tijdens een experiment verschuiven.

Verder kan de stroomsnelheid worden aangepast tot 1 ml per minuut zonder de oogjes te verstoren. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.