Brain Stimulation Snijd met behulp van een Microfluïdische Netwerk en Standard Perfusie Kamer

Het hoofddoel van het project dat we u vandaag gaan tonen, is om de stimulatie van de hersenplakken ruimtelijk en temporeel te kunnen beheersen. Een ander belangrijk punt is dat we, door middel van een eenvoudige aanpassing in de reeds complexe elektrofysiologische opstelling, dit microfluidische apparaat kunnen verspreiden onder de verschillende laboratoria die daadwerkelijk deze hersenplakstimulatie gebruiken. Hallo, ik ben Java Chek Mohammad van het Edington-lab in de afdeling Bioengineering aan de University of Illinois at Chicago.

Vandaag ga ik u laten zien hoe we een eenvoudig, gefabriceerd microfluïdisch apparaat toepassen voor de stimulatie van hersensnijplaten. Het apparaat voor hersensnijplaten dat we vandaag gaan demonstreren is om verschillende redenen zeer nuttig; de belangrijkste reden is dat het zo modulair is dat het zonder verdere aanpassingen in de bestaande elektrofysiologische opstelling past. Daarnaast voorkomt het het gebruik van slangetjes en pompen, wat elk microfluïdisch apparaat normaal gesproken compliceert.

Omdat we de passieve pompmethode gebruiken, hebben we geen slangjes of pompen nodig. Ten derde gaat het om een dun vel PDMS-membraan dat tussen een dekglasje en een standaard perfusiekamer wordt geplaatst, welke wordt gebruikt in een standaard elektrofysiologische opstelling. De procedure die ik vandaag zal demonstreren, begint met een C8-master, die is gefabriceerd met een standaard SU-8-lithografieproces.

De master die we vandaag hier hebben, is een master op twee niveaus, waarbij het ene niveau het ontwerp van de kanalen, de microkanalen, bevat, en het andere ontwerp is voor de via-openingen die bovenop deze kanalen liggen, zodat de oplossingen die door de kanalen stromen via de via-openingen naar buiten kunnen komen. We maken deze master op een siliciumwafer en gebruiken vervolgens silicone of PDMS om over dit device te gieten, zodat de structuren op de wafer in het PDMS worden gegoten. We gaan nu het PDMS over dit device gieten.

Vervolgens nemen we het PDMS-membraan dat is gevormd na het uitharden en aan een dekglasje is gehecht. Zo hebben we ons microfluïdische apparaat. Daarna gaan we een standaard perfusiekamer aanpassen door een dunne laag PDMS op de bodem van de perfusiekamer aan te brengen.

Zodra we deze aangepaste perfusiekamer hebben, nemen we het microfluïdische apparaat dat we eerder hebben gefabriceerd en hechten we dit aan de perfusiekamer. Er zijn twee kritieke punten bij de fabricage van het microfluïdische apparaat. Ten eerste moet de warmteplaat worden uitgeschakeld voordat we de PDMS aanbrengen, zodat de PDMS niet onmiddellijk uithardt wanneer we het op de wafer gieten.

Een ander kritiek punt is dat de spacers die we in de vier hoeken van de siliciumwafer gebruiken een hoogte moeten hebben die kleiner is dan de hoogste structuur op de siliciumwafer. Dit is om ervoor te zorgen dat de VR-openingen verkregen kunnen worden wanneer we het uithardingsproces voor de PDMS uitvoeren. We bevinden ons hier in deze modulaire cleanroom met zachte wanden en dit is de master die we hebben gefabriceerd met een standaard C8-lithografieproces.

Het betreft een master op twee niveaus, waarbij het eerste niveau het ontwerp van de kanalen bevat met vier inlaatopeningen en één uitlaatopening. In het middelste gebied van alle vier de kanalen bevinden zich via's of posts die bovenop de kanalen staan. Dit zijn de uitlijnmarkeringen die tijdens het fabricatieproces zijn aangemaakt.

En nu ga ik u laten zien hoe ik het ga verwijderen en het PDMS ga uitharden. Vanwege het edge-bead-effect is de dikte in de buitenste periferie van de wafer groter dan bij de eigenlijke apparaten in het centrum van de wafer. Wat we daarom gaan doen, is deze uitlijntekens verwijderen met een scheermesje en vervolgens, om de wafers te ondersteunen, spacers gebruiken met een hoogte van 140 micron, die we in de vier hoeken van de wafer zullen plaatsen.

Zorg ervoor dat het scheermesje de eigenlijke apparaten niet raakt. Nu ga ik deze SVA-deeltjes verwijderen met de persluchtspuit en de wafer is nu klaar voor de voorbereiding van de PDMS-mal. Maar voordat we dat doen, moeten we deze spacers plaatsen, die 140 micron hoog zijn.

Ik ga nu de vier stukjes tape op de vier hoeken van de wafer plaatsen. Vervolgens zorg ik ervoor dat de tape goed op de wafer hecht. De reden waarom de tape 140 micron dik is, is dat de twee-laags master met de kanalen en de VS 150 micron hoog is.

En wanneer we het gewicht bovenop de PDMS plaatsen tijdens het uitharden van de PDMS, willen we ervoor zorgen dat de PDMS-plaat vlak wordt. Daarom gebruiken we vier spacers van gelijke hoogte op de hoeken. Nu ga ik laten zien hoe we de PDMS gaan gieten en uitharden om de apparaten te maken.

Maar voordat ik dat doe, laat ik u zien hoe we de PDMS-oplossing hebben bereid. We nemen 10 delen van de basis en één deel van het hardingsmiddel en mengen dit grondig. Tijdens het mengproces ziet u dat er veel bellen in de PDMS-oplossing ontstaan. Om deze bellen te verwijderen, plaatsen we de PDMS in de vacuümkast. Na het plaatsen van de PDMS gedurende 10 minuten in de vacuümkast zijn er geen bellen meer aanwezig.

En nu is de PDMS klaar voor het uitharden. Nu ga ik laten zien hoe we de PDMS op de wafer aanbrengen en uitharden om het PDMS-membraan te verkrijgen. Ik ga de PDMS op de wafer aanbrengen en vervolgens deze transparantie gebruiken om de PDMS te bedekken.

Dit helpt ons om de apparaatondersteuning te verwijderen, het apparaat van de transparante folie te scheiden, waarna ik de gewichten bovenop de transparante folie zal plaatsen. De reden voor het gebruik van de gewichten is om een uniforme dikte van het PDMS te verkrijgen. Een ander kritiek punt is het verkrijgen van de via-openingen.

Dus overal waar vd's zijn, willen we geen PDMS, en de gewichten zullen ons helpen om dat te bereiken. Zoals u hier kunt zien, is de warmteplaat uitgeschakeld en de reden daarvoor is dat we niet willen dat de PDMS onmiddellijk uithardt, dus we laten hem uit. Daarnaast moet u ervoor zorgen dat de wafer vlak is voordat u de PDMS giet.

Nu kunnen we de PDMS die we eerder hebben voorbereid overbrengen. Zorg ervoor dat u de PDMS dicht genoeg bij de wafer doseert, zodat er geen bellen ontstaan. Het meest kritische punt hier is de manier waarop u de transparante laag bovenop de PDMS plaatst.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan door het plaatsen van de folie. Nu plaats ik een van deze glazen plaatjes om het overtollige PDMS weg te laten vloeien. Ik plaats nog drie glazen plaatjes om ervoor te zorgen dat ze voor deze specifieke master niet verschuiven.

En voor deze specifieke kenmerken hebben we vastgesteld dat het plaatsen van deze vier glazen plaatjes ervoor zorgt dat het overtollige PDMS uit de ruimte tussen de transparante laag en de wafer kan ontsnappen. We wachten één tot twee minuten en kunnen vervolgens de warmteplaat starten. Afhankelijk van de verschillende masters en ontwerpen moet u mogelijk het aantal glazen plaatjes verhogen of verlagen om de via-openingen te verkrijgen. De warmteplaat is nu klaar om ingeschakeld te worden en ik stel een temperatuur van 75 °C in.

Zodra een temperatuur van 75 °C is bereikt, kunnen we de timer voor één uur instellen en het PDMS laten uitharden. Nu we het PDMS een uur hebben laten uitharden, kunnen we de warmteplaat uitschakelen en laten afkoelen tot 50 °C. De reden hiervoor is om te voorkomen dat de SEA scheurt.

Als we het onmiddellijk van 75 graden naar kamertemperatuur brengen, kunnen we het nu uitschakelen en wachten tot de temperatuur is gedaald naar 50 °C. Nu de temperatuur van de warmteplaat is gedaald naar 50 °C, kunnen we de gewichten van de transparante folie verwijderen. Nu kunnen we de wafer van de warmteplaat halen en deze is klaar om gesneden te worden.

Nu is het PDMS-vel klaar om van de C8-master te worden verwijderd en moeten we de aluminiumfolie verwijderen. Vervolgens moeten we het transparante vel verwijderen. We hebben hier de standaard perfusiekamer.

We hebben het aangepast zodat we het kunnen uitlijnen. De gaten, inlaat- en uitlaatpoorten van het microfluïdische apparaat. Dit zijn de vier inlaatpoorten en één uitlaatpoort op het PDMS-membraan.

Deze moeten overeenkomen met de vier inlaataansluitingen en de ene uitlaataansluiting van de perfusiekamer. Ik schuif nu de perfusiekamer op zijn plaats en lijn deze uit met de gaten in het PDMS-membraan. Nu ze zijn uitgelijnd, kan er worden gesneden.

Nu kan de kamer worden verwijderd met behulp van een probe. Zorg ervoor dat alle randen van het PDMS-membraan vrij zijn om verwijderd te worden. Zodra dit is gedaan, kan een vriezer worden gebruikt om het PDMS-membraan te verwijderen; zorg erbij tijdens het verwijderen van het PDMS van de bovenkant van het apparaat voor dat u het PDMS zeer langzaam beweegt, zodat u het PDMS-membraan niet scheurt.

Ik plaats nu het PDMS-membraan met de holtes die gevormd zijn met de SC acht masters bovenop en zorg ervoor dat het vlak ligt. De reden hiervoor is dat het PDMS aan de zijde die aan het dekglas wordt gebonden, niet ruw is wanneer we de gaten voor de inlaat- en uitlaatpoorten maken.

We moeten er dus voor zorgen dat de holtes zich aan de bovenzijde bevinden. Nu kunnen we de inlaat- en uitlaatpoorten maken, zodat we de gaten duidelijk kunnen zien. We voegen een zwarte achtergrond toe.

Nu ga ik de in- en uitlaatpoorten maken; zorg ervoor dat er geen PDMS bij de poort achterblijft. Daarom verwijderen we alle PDMS. Vervolgens gaan we het PDMS-membraan overbrengen naar een ander transparant vel.

Vervolgens kunnen we de plaat en het dekglas behandelen met plasma en deze zo neerleggen dat de holtes opnieuw aan de bovenzijde zitten. Zodra dit oppervlak met plasma is behandeld en het dekglas met plasma is behandeld, kunnen we deze twee oppervlakken samenvoegen om het microfluïdische netwerk te vormen en de luchtbellen tussen de PDMS-plaat te verwijderen. Voor de transparantie kan plakband worden gebruikt.

Dit zorgt ervoor dat de PDMS-plaat vlak is en dat de hechting veel beter verloopt. Gebruik vervolgens opnieuw plakband op het bovenoppervlak om eventueel stof van het PDMS-membraan te verwijderen. Nu kunnen we het dekglas plaatsen dat we aan het PDMS-membraan zullen hechten.

En nu zijn deze twee PDMS en het glas klaar voor de plasmaprebehandeling. We gaan de PDMS en het dekglas behandelen met plasma met behulp van dit gemodificeerde magnetronsysteem, waarbij u kunt zien dat deze glaskamer ons in staat stelt om plasma binnen in deze magnetron te genereren. Ik plaats nu de monsters binnenin en creëer een vacuüm in de kamer.

Nu kan ik zuurstof laten stromen. Het plasmasysteem is nu gereed voor gebruik en ik ga voor dit specifieke systeem 10% vermogen en 10 seconden gebruiken om het plasma te helpen visualiseren. Terwijl de plasmabehandeling gaande is, hebben we het vermogen verhoogd naar honderd procent en hebben we de lichten uitgedaan.

En nu kunt u het plasma zien direct na de plasmabehandeling. U moet beide oppervlakken, het dekglas en de PDMS, direct aan elkaar hechten, anders verliest het PDMS-oppervlak zijn hydrofiliciteit als gevolg van de plasmabehandeling. Zorg er bij het plaatsen van het dekglas voor dat het gehele oppervlak aan elkaar is gehecht zonder luchtbellen.

Indien er luchtbellen aanwezig zijn, kunt u deze verwijderen. Laat het geheel nu vijf minuten staan om te hechten. Hier hebben we de aangepaste perfusiekamer, waarbij we de bodem van de kamer hebben gemodificeerd met PDMS.

En dit is eerder gedaan. We hebben een transparante plaat op een warmteplaat geplaatst die was uitgeschakeld. Vervolgens hebben we de PDMS gegoten die op een vergelijkbare wijze was bereid als eerder aangetoond.

Vervolgens hebben we de perfusiekamer bovenop de PDMS geplaatst, daarna een enkel gewicht geplaatst zoals hier getoond, en dit 30 minuten lang laten uitharden bij 75 °C. Terwijl we wachten tot de binding tussen de PDMS en het dekglas plaatsvindt, zal ik laten zien hoe we de kamer kunnen voorbereiden. Zo kunnen we de kamer en het microfluïdische apparaat aan elkaar hechten.

Daarom moeten we overtollig PDMS verwijderen van alle plaatsen waar het niet nodig is. Verwijder eerst de transparantie en daarna het PDMS. Vervolgens moeten we het PDMS uit de in- en uitlaatpoorten verwijderen. Nu is de kamer klaar om verbonden te worden met het microfluïdische apparaat dat we eerder hebben voorbereid.

Nu we vijf minuten hebben gewacht, kan het microfluïdische apparaat van de transparante folie worden gescheiden, maar zorg ervoor dat u de folie langzaam verwijdert. Zo wordt voorkomen dat de PDMS en het dekglas van elkaar loskomen. Nu de perfusiekamer gereed is, moeten we het onderste oppervlak van de kamer, waar we zojuist de PDMS hebben aangebracht, en het bovenste oppervlak van het microfluïdische apparaat met de PDMS erop, behandelen met plasmaplasma.

We plaatsen nu beide stukken in de plasmakamer en voeren de plasmabehandeling uit bij 10% vermogen gedurende 10 seconden. Nu zijn beide oppervlakken behandeld met plasma en zijn ze klaar om gebonden te worden. Voordat u ze bondt, moet u ervoor zorgen dat de in- en uitlaatpoorten van de kamer uitgelijnd zijn met het microfluïdische apparaat.

Omdat de kenmerken die we uitlijnen groot genoeg zijn, is er geen speciale apparatuur nodig en kan dit met het blote oog worden gedaan. Zodra u de uitlijning heeft voltooid en het op de kamer heeft geplaatst, dient u ervoor te zorgen dat alle oppervlakken contact maken, waarna u het vijf minuten kunt laten rusten. Na een wachttijd van vijf minuten is de binding voldoende voor de experimenten.

Nu het microfluïdische apparaat aan de kamer is gehecht, gaan we de kanalen op het kanalisoppervlak hydrofiel maken. Hierdoor kunnen de A CFS-oplossing of andere neurotransmitters gemakkelijker door de kanalen stromen. Ik zal het volledige apparaat in de plasmaplasma plaatsen en het één minuut lang behandelen bij 10%, zodat de volledige binnenkant van de kanalisoppervlakken hydrofiel wordt.

Vervolgens vul ik het met water en breng ik het naar de elektrofysiologische opstelling, zodat we de eigenlijke experimenten kunnen uitvoeren. Oké, we zijn nu klaar om naar de elektrofysiologische opstelling te gaan en dit apparaat daadwerkelijk te gebruiken met de hersensectie. Hallo, mijn naam is uo.

Ik werk samen met Dr. Arrington en Dr. Fall van de afdeling Bioengineering aan de University of Illinois. Nu ga ik aan de slag met het microfluïdische apparaat dat ik heb meegenomen en dat zich op dit platform bevindt. Aan één zijde zijn de perfusieslangen zichtbaar.

Aan de andere kant zien we de zuigslang. Het apparaat zal worden geperfuseerd met een CSF-oplossing, die is verzadigd met 95% zuurstof en 5% CO2. Nu het micro-V-apparaat gereed is, ga ik de hersenslices pakken om deze vervolgens op het micro-apparaat te plaatsen.

Ik ga nu de hersensnede op de ronde openingen plaatsen en vervolgens de ankerpunten gebruiken om de hersensnede te immobiliseren. Nu de hersensnede is gefixeerd, ga ik neurotransmitters gebruiken om deze te stimuleren. Hier zijn vier inlaaten; ik ga in elke inlaat neurotransmitters plaatsen, waarbij gebruik wordt gemaakt van passieve pomping van deze vier inlaaten naar deze uitlaat.

En nu gaat Dr. Fall vertellen over dit apparaat. Waarom is dit zo belangrijk voor ons? Hallo, ik ben Chris Fall en wij houden ons bezig met hersenfysiologie.

De reden waarom we hersensnijden moeten gebruiken, is om toegang te krijgen met micro-elektroden en beeldvormingstechnologie. Tot nu toe was de enige manier om de neurotransmitteromgeving voor deze hersensneden te veranderen, het aanpassen van de stroming over de gehele snede of het direct toedienen van neurotransmitters met behulp van een zeer kleine micropipet. We zijn daarom erg enthousiast over de samenwerking met de groep van Eddington.

Deze nieuwe technologie stelt ons in staat om grote gebieden van de hersenen aan te spreken en lokaal de neurotransmitteromgeving te veranderen. Tegelijkertijd kunnen we nu onze elektroden en beeldvormingstechnologie inzetten en wellicht uiteindelijk apparaten voor multi-elektrodeopname in dezelfde eenheid integreren. Oké, hier ziet u een plakje muizenbrein in het microfluïdische apparaat.

U kunt zelfs met het blote oog zien dat de hersenen uit vele verschillende regio's bestaan. Deze regio's vervullen verschillende functies. En in het levende dier zouden deze verschillende hersenregio's verschillende neuromodulatoire en neurotransmitter-tonussen hebben.

En we willen dit kunnen repliceren in onze slice-kamer terwijl we elektrofysiologische en imaging-opnames maken. Daarom is het zeer waardevol om deze verschillende gebieden te kunnen adresseren met verschillende neurotransmitters in verschillende concentraties en met verschillende tijdskoersen. Hoewel we neurotransmitters niet echt kunnen visualiseren, kunnen we hier een voorbeeld laten zien van een fluorescente kleurstof die in verschillende regio's in de hersensectie wordt gepompt.

Hier ziet u een video waarin we fluorescerende kleurstof door de kanalen van het apparaat laten stromen en visualiseren hoe deze uit de gemaakte poriën komt. Zelfs in dit vroege prototype is te zien hoe nauwkeurig de ruimtelijke resolutie van de stroming is. Terwijl we de video bekijken, ziet u de kleurstof de kanalen instromen en vervolgens uit de gaten treden, waarna we de kleurstof wegspoelen om u een idee te geven van de temporele resolutie van de stroming.

Bedankt dat u vandaag bij ons was. Ik denk dat we hebben kunnen aantonen hoe microfluidica en micro-machines kunnen worden gecombineerd met traditionele fysiologische technieken om ons te helpen begrijpen hoe de hersenen werken. Bedankt.