Fabricage en exploitatie van een zuurstof Inzetstuk voor hechtend Cellular Culturen

Het hypoxische insert-apparaat heeft zes pilaren die in de putjes van een six-wellplaat passen. Gas stroomt over het microfluïdische netwerk aan de basis van de pilaar en kan diffunderen door het gasdoorlatende PDMS-membraan, dat het gasnetwerk en het kweekmedium scheidt. Dit apparaat minimaliseert de diffusie-padlengte tussen de zuurstofbron, het microfluïdische netwerk aan de basis van de pilaar en de cellen, waardoor een snellere equilibratie van de zuurstofconcentratie mogelijk is.

Het apparaat maakt bovendien een veel grotere controle mogelijk over het ruimtelijke patroon van zuurstof waaraan de cellen worden blootgesteld, wat wordt bepaald door het ontwerp van het microfluidische gasnetwerk dat is vervaardigd via standaard fotolithografie met behulp van fotomaskers. Hallo, ik ben Sean Ard van het lab van Dr. David Edington van de afdeling Bioengineering aan de University of Illinois in Chicago. Hallo, ik ben Ellie, ook van het Edington Lab.

Vandaag laten we u zien hoe u een aangepast apparaat kunt vervaardigen, valideren en gebruiken om in vitro celculturen in een zeswells plaat bloot te stellen aan verschillende zuurstofconcentraties. Wij hebben deze procedure in ons laboratorium gebruikt om het effect van zuurstof op wondgenezing, de generatie van reactieve zuurstofverbindingen en migratie te bestuderen. Laten we beginnen.

Om te beginnen met de fabricage van de oxygenatie-insert, bereid Polymethylsiloxaan of PDMS voor in een verhouding van 10 op één tussen prepolymeer en uithardingsmiddel. Volgens de instructies van de fabrikant wordt het PDMS-mengsel toegevoegd aan een eerder gefreesde mal, waarvan het patroon de vorm van een standaard zes-wells kweekplaat nabootst. Zodra het mengsel gedurende één nacht is uitgehard bij 75 °C, vormt de resulterende gegoten replica van het pijlerarray het eerste van de drie componenten die de oxygenatie-insert vormen, om vervolgens het tweede cruciale component van de oxygenatie-insert te fabriceren.

Een SU-8 master wordt voorbereid door eerst SU-8 2150 te spinnen. Op een siliciumwafer wordt een fotomasker aangebracht en de SU-8 wordt via het fotomasker blootgesteld aan UV-straling om een mastermal te creëren met een microkanaaldikte van 300 µm. Giet PDMS bovenop de SU-8 master en laat dit twee uur uitharden bij 75 °C om een positieve mal te verkrijgen die uiteindelijk de microkanalen aan de onderzijde van elke pilaar zal vormen.

Het derde onderdeel van het apparaat wordt vervaardigd door PDMS op een siliciumwafer te spinnen bij 500 RPM gedurende 10 seconden, gevolgd door 900 RPM gedurende 30 seconden om een membraan te verkrijgen met een dikte van 100 micrometer. Omdat PDMS gasdoorlatend is, kan zuurstof rechtstreeks via dit membraan in de microkanalen worden geleverd. Zodra alle componenten zijn voorbereid, wordt elk hechtvlak gedurende één minuut onderworpen aan een zuurstofplasmabehandeling.

Bond eerst de zes microkanaalcomponenten aan de pilaarray met behulp van een handheld plasmatoestel, en maak vervolgens twee gaten in elke pilaar die dienen als gasin- en uitlaten. Bond ten slotte het membraan aan de onderkant van het microkanaal om de hechting te vergemakkelijken en eventuele bellen te verwijderen. De plasmabehandelde oppervlakken worden ongeveer een minuut op elkaar gedrukt met het platte uiteinde van een pincet; wacht een uur tussen elke bondingstap om er zeker van te zijn dat het apparaat volledig is verbonden en kan worden gekalibreerd.

Zodra een volledig apparaat is gefabriceerd, moet het zuurstofniveau dat de cellen ontvangen bij het gebruik van de oxygenatie-insert in werkelijke experimenten worden gekalibreerd. Gebruik voor de kalibratie een fluorescente zuurstofsensor of foxy-slide, die een fluorescerende ruthenium-kleurstofcoating bevat die door zuurstof wordt gedoofd. Foxy-slides zijn voorgesneden om in de bodem van een zes-wells plaat te passen.

Het foxy-OBJECTGLAS moet zo worden gesneden dat het zoveel mogelijk van het well-oppervlak bedekt. Aangezien het foxy-OBJECTGLAS een dikte van ongeveer één millimeter heeft, dient het apparaat te worden aangepast om de gewenste afstand voor adequate membraandiffusie van het objectglas te handhaven.

Deze afstand hangt af van het experiment, maar dient in de meeste gevallen minder dan één millimeter te zijn. Gebruik het handbeden plasmatoestel om glazen microscoopglaasjes van één millimeter dik in stukken te snijden. Bevestig steunpunten van ongeveer zes millimeter lang en vier millimeter breed aan de onderzijde van het apparaat. Het apparaat zal rusten op de steunpunten bovenop het uitgesneden glaasje.

Glazen dekglasjes kunnen ook worden gebruikt voor een diffusiespleet van 0,17 millimeter om het zuurstofverbruik te valideren. Voeg drie milliliter gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur toe aan de putjes van de zes-well plaat waarin het zuurstofgehalte zal worden gemeten. Plaats het apparaat in de plaat en selecteer met de Metamorph-software het aantal en de locatie van de gewenste posities op de Foxy-sensor.

Schuif de dia naar de assay voor zuurstofconcentraties. Verbind de tai gun-slangen tussen de zuurstofgastank en het hypoxische inzetstuk. Een precisiedoorstroomregelaar, ingesteld op een debiet van 50 tot 100 milliliter per minuut, wordt gebruikt voor een nauwkeurige controle van het geleverde gas.

Zorg ervoor dat de precisiedrukmeter gesloten is. Open eerst de regulator bovenop de tank, gevolgd door de precisiedrukmeter. Verlaag na 15 minuten de stroomsnelheid naar een waarde tussen 10 en 20 per minuut.

Om de vorming van bellen in het water te voorkomen, dient de stroomsnelheid gedurende het volgende uur nauwlettend in de gaten te worden gehouden en indien nodig te worden aangepast, aangezien de drukval zal veranderen terwijl het systeem stabiliseert, wat de stroomsnelheid beïnvloedt bij het maken van beelden van de plaat en de foxy-sensoren. Er wordt gebruikgemaakt van een Olympus IX 71-microscoop uitgerust met fluorescentie, een charge-coupled device-camera van Q Imaging Tiga, SRV en Metamorpho-beeldacquisitiesoftware. De microscoop is uitgerust met een Olympus 3 1 0 2 0, een foxy-compatibel fluorescentiefilter met een excitatiegolflengte van 475 nanometers en een emissiegolflengte van 600 nanometers.

Om de equilibratietijd en de mate van oxygenatie van het apparaat te testen, kiest u drie punten op de foxy-dia waarin de zuurstofconcentratie wordt gemeten. Maak een afbeelding van de dia vlak voordat de gasstroom wordt gestart. Maak afbeeldingen met intervallen van 10 seconden gedurende 30 minuten terwijl het gas door het apparaat stroomt, om de heterogeniteit en de zuurstofafgifte te testen.

Stel meerdere punten vast met intervallen van één millimeter over de breedte van het kanaal en meet de zuurstofconcentratie aan het oppervlak van de put met Metamorph. Exporteer de gemiddelde beeldintensiteit voor elke positie en zet de zuurstofconcentratie uit tegen de fluorescentie-intensiteit. Genereer een kalibratiecurve door lineaire curves te fitten aan de lijn van 0 tot 10% en de lijn van 10 tot 21%, waarbij de fluorescentie-intensiteit aan de zuurstofconcentratie wordt gerelateerd. Voor elke gemeten positie kunnen de ruwe intensiteitsgegevens vanuit Metamorph worden geëxporteerd en verder worden geanalyseerd met Microsoft Excel of andere statistische software.

Zodra het apparaat is gekalibreerd, kunnen experimenten zoals wondgenezingsassays beginnen; autoclafeer de gekalibreerde inzet bij 121 °C gedurende 15 minuten binnen 24 uur vóór het experiment en werk ermee in een laminaire flow-cultuurkap om daaropvolgende contaminatie te voorkomen. Week de gesteriliseerde PDMS-inzet 24 uur in serumvrij medium om gasbellen te voorkomen bij het plaatsen in de putjes van de plaat; kweek MDCK-cellen of andere adherente cellen tot 100% confluentie in een zes-putjesplaat en maak rechte krassen in de monolagen met een P 200 pipetpunt. De krassen simuleren wonden in de adherente monolaag.

Zuig het celmedium af zonder de monolayer te verstoren en spoel met vijf milliliter medium. Zuig opnieuw af en vul de wells weer aan met drie milliliter serumvrij medium. Plaats het apparaat voorzichtig in de plaat, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen ontstaan.

Door het apparaat schuin te houden tijdens de insertie kunnen luchtbellen aan één zijde worden verdreven. Wees voorzichtig om overmatige druk op het apparaat te vermijden, aangezien dit het PDMS zodanig kan vervormen dat de onderliggende cellen worden geplet. Plaats de plaat en het apparaat op een verwarmde microscooptafel van 37 °C en verbind de slang van de gastoevoertank met de inlaat- en uitlaatpoorten van het apparaat.

De kweekincubator moet een opening hebben om de invoer van slangetjes mogelijk te maken en de slangetjes moeten worden aangesloten. Nadat het apparaat in de incubator is geplaatst, dient dezelfde procedure voor het starten van de gasstroom te worden gevolgd als eerder beschreven om de wondgenezing te beoordelen; maak elke 20 minuten gedurende 15 tot 18 uur time-lapsebeelden van de cellen met de eerder beschreven apparatuur en beeldverwerkingssoftware. Een algoritme voor het meten van de kraswond kan worden gebruikt om het niet genezen oppervlaktegebied na een gewenste experimentele duur te analyseren. Stop de gasstroom, verwijder de plaat en ga eventueel over tot verdere celverwerking. Het hypoxische insert-apparaat heeft minder dan twee minuten nodig om te stabiliseren tot 0,5% zuurstof, zoals hier getoond.

De grootte van de opening aan de onderzijde van de membraanput van het apparaat was een kritische factor bij het bepalen van de equilibratie-efficiëntie, waarbij grotere openingen meer tijd vereisten om steady-state zuurstofconcentratiewaarden te bereiken. Het apparaat biedt bovendien een grote mate van controle over de ruimtelijke oxygenatie in een enkele put, waardoor de vorming van meerdere condities mogelijk is en zelfs een cyclisch zuurstofprofiel over het oppervlak van de put kan worden gegenereerd. MDCK-celmonolagen werden blootgesteld aan 10% of 21% zuurstof en het oppervlak van de wond werd in de loop van de tijd geanalyseerd met behulp van het MATLAB Ts scratch wound tailing-algoritme.

Na 11 van de in totaal 17 uur bleef er 6,87% van de oorspronkelijke wond over bij blootstelling aan 10% zuurstof, terwijl 64,4% van de wond bleef bestaan bij 21% zuurstof. Zoals hier wordt getoond, zijn de zuurstofconcentraties negatief gecorreleerd met het open wondoppervlak voor beide zuurstofconcentraties. Gedurende de duur van het experiment hebben we aangetoond hoe de hypoxische insert wordt gefabriceerd, gevalideerd en gebruikt voor een scratch wound healing assay. Het apparaat biedt verschillende voordelen ten opzichte van andere oxygenatiesystemen, zoals een kleinere ruimtebehoefte in het laboratorium en een veel grotere controle over de ruimtelijke en temporele oxygenatie aan het celoppervlak.

Het apparaat kan worden gebruikt door vrijwel elk laboratorium dat het effect van zuurstof of andere gassen, zoals koolstofdioxide, op in vitro celculturen bestudeert. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het gesteriliseerde apparaat en de cultuurmedia een nacht te laten weken en de vorming van bellen tijdens het experiment te minimaliseren. Laat daarnaast het systeem equilibreren voordat u met het experiment begint.

Dit komt doordat de stroomsnelheid verandert wanneer de druk in het systeem zich gelijkstelt. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.