Gesloten systeem Cultuur van de Cel Protocol gebruik HyperStack Schepen met een zuurstofdoorlatende Material Technology

Het algemene doel van deze procedure is om het correcte gebruik van de Corning Hypers stack vessels als gesloten systeem te demonstreren. Dit wordt bereikt door de vaten eerst te inoculeren en te vullen met medium via de zwaartekrachtmethode. Vervolgens wordt de celsuspensie in elke laag geïsoleerd en worden de cellen geïncubeerd.

Na de incubatie wordt het gebruikte medium verwijderd. De laatste stap van de procedure is het oogsten van de cellen uit de hypers stack-vaten. Uiteindelijk worden gasdiffusieresultaten verkregen om aan te tonen dat cellen toegang hebben tot zuurstof tijdens de groei naar confluentie bij gebruik van het gesloten hypers stack-systeem.

Het belangrijkste voordeel van het hypers stack vessel met gasdoorlatend materiaal is dat het een vergroot oppervlak biedt voor celgroei. Door de headspace in het vat te elimineren, zal mijn collega p pardo nu een protocol voor een gesloten systeem demonstreren voor het gebruik van het hypers stack vessel. Het hypers stack vessel bestaat uit een stat, wat het individuele celkweekcompartiment is dat is samengesteld uit de bovenplaat en de gasdoorlatende film.

De cellen worden in dit compartiment gekweekt. De vloeistofmanifold verbindt elke ette-laag binnen een module met elkaar. Modules zijn via slangetjes verbonden om reservoirs te vormen in veelvouden van 12 lagen.

De manifold stelt de gebruiker in staat om één vloeistofmanipulatie op het gehele vat uit te voeren. De luchtmanifold verbindt ook de stat-lagen met elkaar, maar wordt gebruikt om lucht uit het vat te verdrijven wanneer vloeistoffen worden toegevoegd en bevat een vullijn voor gebruik tijdens het vullen tussenbeidse stappen. De stat-laag is een open luchtruimte, genaamd de tracheale ruimte, waardoor gasuitwisseling kan plaatsvinden via de gasdoorlaatbare film van elke laag.

De slang voor vloeistofbehandeling is verbonden met het vloeistofverdeelstuk en is een aanpasbaar component dat wordt gebruikt voor alle vloeistofmanipulaties in een gesloten systeem om overtollige lucht te laten ontsnappen terwijl de steriliteit behouden blijft. De ontluchtingsslang wordt gebruikt. De ontluchtingsslang is verbonden met het luchtverdeelstuk en bevat een luchtfilter.

Aan de slangen voor vloeistofbehandeling zijn de aandrijfslang en het filter verbonden, die worden gebruikt om de vloeistof uit de slangen voor vloeistofbehandeling te trekken nadat het vat is gevuld. In dit protocol wordt ook de Corning Stack manipulator of CSM gebruikt, een hanteerapparaat dat helpt bij het plaatsen van de vaten in de juiste posities tijdens het gebruik. In deze demonstratie wordt celkweek in een gesloten systeem getoond voor een gasdoorlatend vat met 36 lagen.

Bij het gebruik van een CSM kunnen details voor het uitvoeren van deze procedure op een vat met 12 lagen met behulp van een vulwig worden gevonden in het bijbehorende schriftelijke protocol. Begin met het bereiden van 3,9 liters bagged media voordat de mediatube wordt geïnoculeerd. Voeg de serumzak toe aan de mediapzak en meng grondig om de gewenste serumconcentratie te verkrijgen.

Klem ongeveer 300 milliliter medium in de zak af met grote zakkenklemmen. Dit zorgt ervoor dat alle geïnoculeerde cellen tijdens het vullen worden gebruikt en dat er geen cellen in de mediumzak achterblijven. Plaats het medium op een zakkenstandaard om het medium te inoculeren.

Vul een spuit die is verbonden met slang met de cel-suspensie. Bevestig de spuit met de cel-suspensie aan de mediumzak middels tube welding. Gebruik een stuk slang van 3 over 16 inch van de spuit naar de zak.

Injecteer de celsuspensie in de mediazak en meng dit goed. De geïnoculeerde mediazak kan met behulp van tube welding of multifunctionele connectoren worden bevestigd aan de drie over acht inch vloeistofbehandelingsslang van het vat. Vandaag maken we gebruik van tube welding.

Sluit de klemmen op de vloeistofbehandeling- en spoeltubuli van het vat. Plaats het vat met 36 lagen in de laadpositie van de CSM. Bevestig de ontluchtingsfiltertubulus in de houderklem op de CSM.

Draai het deksel vast en breng de CSM naar de vulpositie, zodat het luchtfilter in de hoogste positie komt te staan om bevochtiging tijdens de vuloperatie te voorkomen. De hoek van 10 graden maakt tevens een equilibratie van de vloeistof naar de lagen mogelijk tijdens het vullen, waarbij lucht uit de vullijn wordt verdreven. Positioneer de mediabag op hetzelfde niveau als het vat, terwijl de klem van de chase-tube gesloten blijft.

Open de klem van de vloeistofoverdrachtbuis en de klem van de mediumzak om vloeistof in het vat te laten stromen. Til de mediumzak met behulp van het zakkenstatief omhoog om de cel-suspensie in het vat te laten vloeien. Vul het vat totdat al het geïnoculeerde medium in het vat is gestroomd.

Het bovenste gedeelte van de mediabag moet nog 300 milliliters medium bevatten. Verwijder de klem van de mediabag om het vat verder te vullen naarmate de vloeistof het bovenste luchtverdeelstuk nadert. Verlaag de mediabag om de vulsnelheid te vertragen en overvulling te voorkomen.

Breng het vloeistofniveau langzaam tot aan de vullijn en klem de slang voor vloeistofbehandeling af. Breng het vat in de CSM naar de isolatiepositie en plaats beide sets manifolds in de hoogste positie. Laat de mediabag zakken tot onder de hoogte van het vat.

Open de klem van de spoelbuis terwijl het spoelfilter in een rechtopstaande positie wordt gehouden. Hierdoor wordt het medium in de vloeistofbehandelingsbuis geleegd of teruggespoeld naar de mediumzak. Zodra de slang leeg is, sluit u de klem op de slang van de mediumzak.

Houd het filter van de chase-buis in een rechtopstaande positie. Open de klem op de vloeistofbehandelingsbuis van het vat om eventuele resterende vloeistof in het vat te laten stromen en te laten equilibreren. Wacht één tot twee minuten tot dit is gebeurd.

Draai vervolgens het vat in de CSM zodat de manifolds zich aan de linkerkant bevinden. Breng het vat naar de laadpositie op de CSM. Sluit de klemmen op zowel de chase- als de vloeistofbehandelingsslangen.

De mediabag kan nu uit het vat worden verwijderd, of hij kan bevestigd blijven voor later gebruik tijdens de oogstprocedure. Om de bevestigde mediabag op te bergen, rolt u de mediabag op en plaatst u deze onder de bevestigingsbanden in de opbergtray van het vat. Plaats het vat tot slot in de incubator. Let er bij het transporteren van het vat op dat er geen vloeistof in het luchtventilatiefilter terechtkomt.

Dit wordt bereikt door het uiteinde van het manifold lichtjes omhoog te kantelen. Om de oogstprocedure te starten, last u de cellenassociatie-oplossing en de quench-zakken aan elkaar om de oogstzak-assemblage te vormen; zorg ervoor dat alle slangkenmerken gesloten zijn. Verwijder het vat uit de incubator en plaats het in de CSM in de laadpositie.

Maak de mediumzak los van onder de bevestigingsbanden en hang deze aan het statief. Draai vervolgens het deksel vast om het vat te verzegelen. Bevestig de ontluchtingsslang in de klem en verplaats de CSM naar de vulpositie.

Zorg ervoor dat de mediabaag aan het bagstatief lager hangt dan het vat. Open de klem op de slang van de mediabaag en de vloeistofbehandelingsslang van het vat om het medium in de aangekoppelde baag te laten stromen. Zodra het vat voor ongeveer driekwart leeg is, wijzigt u de CSM-instellingen naar de definitieve lege positie.

Wanneer het vat en de slangen voor vloeistofbehandeling leeg zijn, til de slangen op om het medium voorbij de klem op de slang van de zak voor verbruikt medium te duwen. Sluit vervolgens zowel de klem op de slang voor vloeistofbehandeling als de klem op de slang van de zak voor verbruikt medium. Vervang de zak voor verbruikt medium door de oogstzak-assemblage middels tube welding.

Verhoog de montage van de cel-dissociatiezak met behulp van de zakhouder tot boven de hoogte van het vat. Plaats de CSM in de vulpositie. Open de klem van de buis voor de cel-dissociatieoplossing en de klem van de oogstzakmontage en overbreng de oplossing naar het vat.

Wanneer de overdracht is voltooid, sluit u de klemmen op de slang voor vloeistofbehandeling en de slang voor de cel-dissociatieoplossing. Breng vervolgens de CSM naar de laadpositie terwijl u de hendel voor de horizontale positionering openhoudt. Schommel het vat voorzichtig heen en weer met behulp van het wiel, zodat de oplossing over de cellagen wordt verdeeld.

Om een gelijkmatige verdeling van de oplossing te waarborgen, kan het vat tijdens het schudden af en toe worden teruggebracht naar de vulpositie. Zodra de oplossing adequaat is verdeeld, laat u de hendel van de CSM los om deze in de vulpositie te vergrendelen. Laat het vat in deze positie staan gedurende de vereiste dissociatietijd voor de cellen.

Gebruik de troebeling als richtlijn om de loslating van de cellen te bepalen. Zodra de cellen zijn losgelaten, verplaatst u het CSM naar de laadpositie. Open de klem van de quench-zak en de klem van de vloeistofbehandelingsslang om het quench-medium in het vat te laten stromen.

Sluit de klem op de slang voor vloeistofbehandeling. Zodra de overdracht is voltooid, brengt u de CSM terug naar de laadpositie en houdt u de hendel voor de horizontale positionering vast om het vat van links naar rechts te kantelen. Verlaag met behulp van de zakhouder de positie van de oogstzakassemblage tot onder het niveau van het vat.

Zet de CSM in de lege positie. Open de klem van de vloeistofbehandelingsbuis van het vat en breng de celoplossing terug naar de quench-zak. Zet de CSM terug in de laadpositie en ontkoppel de oogstzakassemblage van het vat met behulp van een buisdichter.

De celoplossing is nu gereed voor verwerking in traditionele celgroeisystemen. Bij Headspace raakt de zuurstof in het medium gedurende drie dagen met gemiddeld 50% uitgeput. In de cultuur laat deze figuur de afname in milligram per liter zuurstof op het niveau van de cellen over tijd zien in hetzelfde groeisysteem; de zuurstofgradiënt over een mediumhoogte van drie millimeter is bij de overgang van medium naar Headspace bijna 50% groter dan bij de cellaag.

Het zuurstofpercentage in de tracheale ruimte van de hypers-stack tijdens de celgroei wordt weergegeven. De figuur laat zien dat over 96 uur het zuurstofpercentage tussen de lagen, dat elke gasdoorlatende filmbodem van zuurstof voorziet, constant blijft. Dit demonstreert het vermogen van de cellen om toegang te krijgen tot zuurstof tijdens de groei tot confluentie.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een Corning Hypers stack vessel in het gesloten systeem vult en oogst.