Uitgebreide analyse van de samenstelling van de celwanden (lignocellulose biomassa) Deel I: Lignine

Het bepalen van het ligninegehalte en de samenstelling van plantencelwanden begint met gedroogd plantmateriaal, dat wordt onderworpen aan diverse extracties. Het resulterende materiaal bestaat uitsluitend uit celwanden en wordt vervolgens gesplitst om het ligninegehalte te bepalen. Het wandmateriaal wordt onderworpen aan hydrolyse met acetylbromide en de gesolubiliseerde monoïlen worden gekwantificeerd via UV-spectrometrie voor de bepaling van de ligninesamenstelling.

Wandmateriaal wordt gehydrolyseerd door cytolyse. De gesolubiliseerde ligninecomponenten worden vervolgens omgezet in hun vluchtige trimethylsilylderivaten, die gescheiden en gekwantificeerd kunnen worden met gaschromatografie in combinatie met massaspectrometrie. De bepaling van de matrixpolysacharide-samenstelling en het cellulosegehalte wordt gedemonstreerd in een andere video met de titel Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part Two Carbohydrates.

Hallo, ik ben Marcus Pauley, hoofd van de Wall Analytical-faciliteit bij het Great Lakes Bioenergy Research Center hier aan de Michigan State University. Ik ben Cliff Foster, manager van de analytische celwandfaciliteit. We laten u de procedure zien om het gehalte en de samenstelling van plantenbiomassa-monsters te bepalen.

Planten zetten lichtenergie van de zon om in chemische energie, zoals biomassa. Plantenbiomassa bestaat hoofdzakelijk uit celwanden, een complex netwerk van diverse polymeren die alle plantencellen omhullen. Hier bepalen we de samenstelling van plantencelwandmaterialen om het potentieel te beoordelen voor het transformeren van deze lignin Cellose X, welke een zeer overvloedige hernieuwbare bron zijn, naar biobrandstoffen.

Vandaag richten we ons op het polyfenol lignine in een andere video met de titel Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, deel twee koolhydraten. We zullen ons concentreren op de polysacharide-analyse. Om deze procedure te starten, voegt u drie roestvrijstalen kogels van 5,5 millimeter toe aan een schroefsluitbuisje van twee milliliter en ongeveer 60 tot 70 milligram aan lucht- of vriesgedroogd plantmateriaal.

Het materiaal kan worden vermalen tot een fijn poeder met behulp van eyewall, een robot voor het malen en dispenseren. De eyewall neemt de buis en schudt deze 30 seconden lang, waarbij het materiaal door de metalen kogels tot een fijn poeder wordt vermalen; vervolgens wordt het gemalen, maar compacte plantenpoeder losgemaakt via een alternatieve, niet-robotische procedure met een lage doorvoer. Het faciliteren van een retro wordt in deel twee gepresenteerd: voeg 1,5 M 70% waterige ethanol toe aan het gemalen materiaal, vortex grondig en centrifugeer bij kamertemperatuur.

Deze behandeling solubiliseert de meeste eiwitten en celorganellen; aspireer het supernatant en voeg een volume-tot-volumeratio van één-op-één chloroform-methanoloplossing toe aanHet alcohol-onoplosbare pellet. Schud grondig om het pellet te resuspenderen en centrifugeer. De chloroform-methanol extraheert hydrofobe verbindingen zoals lipiden; aspireer na centrifugatie het supernatant en resuspendeer het pellet in 500 µL aceton.

Om het monster te drogen, wordt het oplosmiddel verdampt met een luchtstroom bij 35 °C tot het droog is; de gedroogde monsters kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard tot aan verdere verwerking. Om de verwijdering van zetmeel uit de monsterresiduen te initiëren, wordt het pellet gesuspendeerd in 1,5 µL 0,1 M natriumacetaat pH 5; sluit de buisjes af en verhit deze in een heating block om het zetmeel te gelatiniseren. Voeg na het afkoelen van de suspensie op ijs de zetmeelafbrekende enzymmix toe, sluit de buis af en vortex grondig; laat de suspensie vervolgens overnight incuberen.

In de schudmachine bij 37 °C zorgt een rotatieschudmachine voor een goede menging. Na de incubatie gedurende de nacht wordt de digestie beëindigd door 10 minuten te verhitten in een heating block bij 100 °C. Centrifugeer vervolgens en verwijder het supernatant, dat opgelost zetmeel bevat.

Was de resterende pellet drie keer met telkens 1,5 ml water door te vortexen, centrifugeren en te decanteren, zoals eerder gedemonstreerd. Resuspendeer de pellet tot slot in 500 µL aceton en laat het oplosmiddel verdampen met een luchtstroom bij 35 °C totdat de monsters droog zijn. De gedroogde monsters die geïsoleerde celwand of leg, geen celluloses bevatten, zijn klaar voor verdere analyse en kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard.

Begin met het wegen van één tot 1,5 milligram voorbereid celwandmateriaal. Het materiaal kan handmatig worden gewogen of op geautomatiseerde wijze met de eye wall, zoals gedemonstreerd in deel twee. Spoel de wanden van de buis met 250 microliters aceton om het celwandmateriaal op de bodem van de buis te verzamelen en laat het aceton zeer voorzichtig verdampen onder luchtstroom.

Nadat het aceton is verdampt, voegt u voorzichtig 100 µL vers bereid 25% volume/volume acetylbromide in glaciaal azijnzuur langs de wanden toe. Om spatten te voorkomen, wordt het ligninepolymeer door een kleine hoeveelheid bromide afgebroken tot geacetyleerde monosachariden. Sluit vervolgens de maatkolf en verhit deze gedurende twee uur bij 50 °C.

Verhit een extra uur met vier keer mixen elke 15 minuten en koel vervolgens op ijs. Voeg na het afkoelen van de kolf op kamertemperatuur 400 µL van 2 M natriumhydroxide en 70 µL vers bereide 0,5 M hydroxylaminehydrochloride toe; vortex de maatkolf. Neutraliseer vervolgens de oplossing door de maatkolf precies tot de 2 mL-markering aan te vullen met glaciaal azijnzuur, sluit de dop en keer de kolf meerdere keren om om te mengen. Pipetteer 200 µL van de oplossing die de gehydrolyseerde en gesolubiliseerde monolals bevat in een UV-specifieke 96-wells plaat en lees de plaat uit in een plaatlezer bij 280 nm. Lees de plaat ten minste drie keer en bereken de gemiddelde absorptie, aangezien partikels een geringe variatie in de absorptiewaarden kunnen veroorzaken.

Bepaal het percentage van een bromide-oplosbaar lignine of A BSL met behulp van de passende plantcoëfficiënt via de formule die in het schriftelijke protocol wordt gepresenteerd. Lignine is een polyfenolnetwerk dat hoofdzakelijk bestaat uit drie subunits: P-hydroxyfenol, guaiacyl- en syringyl-eenheden; bepaal de samenstelling van lignine in het plantmateriaal. Begin met het overbrengen van ongeveer twee milligram celwandmateriaal in een glazen buis met schroefdop voor cytolyse.

Bereid vervolgens de 2,5% boorentrifluoride-ethylaat- en 10%sthaanthiol-oplossing in dioxaan voor. Omdat dioxaan zeer gevaarlijk is, mogen er geen monsters of apparatuur uit de zuurkast worden gehaald. Werk zeer zorgvuldig en gebruik een ballon gevuld met stikstofgas om het verloren volume in de dioxaanfles te vervangen door stikstof.

Bereid de oplossing voor door de volgende volumes per monster te mengen: 175 µL dioxaan, 20 µL ETSH en 5 µL BF3. Voeg na het mengen 200 µL van de oplossing toe aan elk monster. Spoel de headspace van het vial met stikstofgas en sluit deze af met een dop.

Verwarm de monsters vervolgens direct vier uur lang bij 100 °C, waarbij aan het einde van elk uur voorzichtig wordt gemengd. Stop de lysisreactie door het mengsel vijf minuten op ijs te plaatsen. Voeg vervolgens 150 µL 0,4 M natriumbicarbonaat toe om te neutraliseren en vortex.

Voeg voor het opzuiveren van de lignine-afbraakproducten 1 ml water en 0,5 ml acetaat toe, vortex en laat de fasen scheiden. De ethylacetaatlaag bevindt zich aan de bovenkant en het water aan de onderkant. Draag 150 µL van de bovenste ethylacetaatlaag die de ligninecomponenten bevat over naar een buisje van 2 ml, waarbij u ervoor zorgt dat er geen water wordt overgebracht.

Verdampt na de overdracht vanuit de bovenste ethylacetaatlaag het oplosmiddel met behulp van een concentrator met luchtstroom. Voeg 200 µL aceton toe en verdampt dit. Herhaal de behandeling met aceton twee keer om overtollig water te verwijderen.

Deriveer vervolgens de ligninecomponenten naar hun vluchtige trimethylsilyl-derivaten. Voeg 500 µL ethylacetaat, 20 µL purine en 100 µL N,O-bis(trimethylsilyl)acetamide toe aan elke buis. Incubeer gedurende twee uur bij 25 °C.

Na het verstrijken van de twee uur worden 100 µL van de reactie overgebracht naar een GC-MS-vial en worden hieraan 100 µL aceton toegevoegd. Analyseer de monsters met GC uitgerust met een quadrupool-massaspectrometer of een vlamionisatiedetector. Raadpleeg voor de kolom en de details van de run het bijbehorende geschreven protocol.

Hier zijn enkele representatieve resultaten van de lignineanalyse met popelhout als plantmateriaal. Volgens deze analyse bestaat 22% van het populmateriaal uit polyphenollignine. De samenstelling van de ligninecomponenten werd geanalyseerd via GCMS.

Pieken worden geïdentificeerd op basis van relatieve retentietijden met behulp van een tetra-coaan interne standaard of aan de hand van karakteristieke massaspectrum-iconen van 2 99 MZ, 2 69 MZ en 2 39 MZ voor respectievelijk de sg- en h-monomeren. De samenstelling van de ligninecomponenten wordt gekwantificeerd door het totale piekareaal op 100% te stellen. De compositionele analyse laat zien dat dit specifieke monster voornamelijk syringyl- of S-eenheden bevat. Desondanks zijn guaiacyl-, alcohol- of G-eenheden ook ruim aanwezig.

Het is duidelijk dat de hoeveelheid en de samenstelling van de monomere eenheden kunnen variëren afhankelijk van het planteweefsel en de soort. We hebben zojuist aangetoond hoe u het ligninegehalte en de samenstelling van plantmateriaal kunt bepalen voor de analyse van polysachariden. Ga naar deel twee.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.