Uitgebreide analyse van de samenstelling van de celwanden (lignocellulose biomassa) Deel II: Koolhydraten

Het bepalen van de samenstelling van de matrixpolysacchariden en het gehalte aan kristallijne cellulose in plantencelwanden begint met gedroogd plantmateriaal, dat wordt onderworpen aan diverse extracties. Het resulterende materiaal bestaat uitsluitend uit celwanden en wordt vervolgens gesplitst om de samenstelling van de matrixpolysacchariden te bepalen. Het wandmateriaal wordt behandeld met een zwak zuur om niet-kristallijne polysacchariden, voornamelijk de hemicelluloses, te hydrolyseren tot hun monosacchariden.

De monosachariden worden vervolgens gederiveerd tot hun overeenkomstige vluchtige aldolacetaten, die vervolgens worden geanalyseerd en gekwantificeerd via gaschromatografie gekoppeld aan een massaspectrometer voor de bepaling van kristallijne cellulose. Celwanden worden behandeld met het graph-reagens, een mengsel van zuren dat niet-kristallijne wandcomponenten verwijdert. De overgebleven kristallijne cellulose wordt afgebroken tot de monomeer glucose, die colorimetrisch kan worden bepaald.

De bepaling van het ligninegehalte en de samenstelling wordt gedemonstreerd in een andere J-videopublicatie met de titel Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part One Lignin. Hallo, ik ben Marcus Pauley, hoofd van de analytische faciliteit voor celwanden bij het Great Lakes Bioenergy Research Center hier aan de Michigan State University. Ik ben Cliff Foster, manager van de analytische faciliteit voor celwanden.

Vandaag laten we u zien hoe u de samenstelling van de polysachariden in het plantencelwandmateriaal bepaalt, dat cellulose is in verschillende Homo celluloses. Hier bij het Great Lakes Bioenergy Research Center ontwikkelen we technologie om deze suikers om te zetten in biobrandstoffen. Om een optimale plantaardige grondstof te kunnen identificeren, moeten we eerst de soort en hoeveelheid suikers bepalen die in deze biomassa aanwezig zijn.

In een andere video met de titel Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, deel één Lignine, zullen we ons concentreren op de polyfenolanalyse. Laten we beginnen. Start deze procedure door de celwanden te isoleren.

Maal ongeveer 60 tot 70 milligram gedroogd plantmateriaal met 5,5 millimeter roestvrijstalen kogels in een twee mil SAR TED schroefdopbuisje. Gebruik een REM-molen als alternatief voor een hoge doorvoer, waarbij gebruik wordt gemaakt van een maal- en doseerrobot genaamd eyewall, zoals beschreven in deel één. Verwijder de stalen kogels wanneer het malen voltooid is.

Ga verder met het isoleren van celwanden en het verwijderen van resterend zetmeel zoals getoond in deel één en beschreven in het bijbehorende geschreven protocol. Weeg twee milligram celwandmateriaal van DS-zetmeel af in een buisje van twee milliliter. Een methode met een hoge doorvoersnelheid om deze taak uit te voeren is met de eyewall-robot.

De robot pakt een buis met gemalen plantmateriaal en maakt een gat in de bodem van de buis. De doorboorde buis wordt vervolgens op een VI-voeder geplaatst. Een lege buis wordt op een balans geplaatst en door middel van vibratie onder het VI-voeder geschoven; het materiaal percoleert door het gat in de geladen bovenste buis naar de lege onderste buis totdat de gewenste hoeveelheid materiaal is verzameld.

Voeg 100 µg acetol toe als interne standaard. Spoel de wanden van de buis met aceton om het celwandmateriaal op de bodem van de buis te verzamelen en laat de aceton zeer voorzichtig verdampen onder een luchtstroom. Voer vervolgens een zwakke zuurhydrolyse uit.

Voeg voorzichtig 250 µL van twee molar trichloroacetic acid of TFA toe aan elk monster, waarbij u ervoor zorgt dat er geen materiaal op de wanden van de buis spat. Sluit de buizen stevig af en incubeer deze 90 minuten bij 121 °C in een heating block. Koel vervolgens de heating blocks en monsters af op ijs en centrifugeer de buizen 10 minuten bij 10.000 RPM.

Overbreng 100 µL van het zure supernatant dat de gesolubiliseerde suikers van het matrixpolysaccharide bevat naar schroefdopbuisjes, waarbij u erop let dat het pelletmateriaal niet wordt verstoord. Het pellet kan worden gebruikt voor de assay voor kristallijne cellulose. Verdamp het TFA in een glazen buis onder een zachte luchtstroom in een verdampingsapparaat.

Voeg 300 µL propan-2-ol toe om overtollig zuur te verwijderen, vortex en laat verdampen bij 25 °C. Herhaal dit in totaal drie keer. Voer een aldol-acetaat-derivatisering uit om identificatie van de monosachariden via gaschromatografie mogelijk te maken.

Reduceer eerst de monosachariden tot hun overeenkomstige open-ring aldolen, die vervolgens worden geacetyleerd. Raadpleeg het bijbehorende schriftelijke protocol voor gedetailleerde instructies. Elke stap van de procedure volgt het eerder getoonde protocol: toevoeging van reagentia, incubatie, verdamping onder een luchtstroom, gevolgd door het verwijderen van overtollige reagentia via verschillende wasstappen.

In de laatste stappen worden de aldolacetaten geëxtraheerd. Voeg eerst 500 µL ethylacetaat toe en zwenk lichtjes. Voeg vervolgens twee ml water toe, sluit de buisjes af en meng deze met een vortexer. Centrifugeer de buisjes gedurende vijf minuten bij 2000 RPM om heldere, gescheiden lagen te verkrijgen, met ethylacetaat bovenop waarin de aldolacetaten zitten en water onderaan. Pipetteer 50 µL van de ethylacetaatlaag in GC-MS-vials met inserts. Verdun door 100 µL aceton aan de GC-vial toe te voegen; de GC-vial kan worden bewaard bij 4 °C.

Indien de GCMS-analyse niet onmiddellijk wordt uitgevoerd, injecteer de monsters dan in een gaschromatograaf die is uitgerust met een quadrupool-massaspectrometer. Raadpleeg het bijbehorende schriftelijke protocol voor de kolom en de details van de run. Het startmateriaal voor het bepalen van het kristallijne cellulosegehalte kan geïsoleerd celwandmateriaal zijn of wandmateriaal dat reeds is behandeld met het zwakke zuur TFA, hetzij direct na de zuurbehandeling of in een bewaarbare gedroogde vorm.

Nadat het overtollige TFA is verwijderd met isopropanol, zoals eerder getoond, voegt u aan het TFA-pellet in de twee M sars in buis één M van het Updegraff-reagens, bestaande uit azijnzuur, salpeterzuur en water, toe in een volumeverhouding van 8:1 tot 2:1. Sluit de buis stevig af, vortex en verhit op een warmteblok bij 100 °C gedurende 30 minuten. Als gevolg van deze behandeling blijft alleen kristallijne cellulose in het pellet over.

Alle overige polysachariden worden gehydrolyseerd. Koel de monsters in het blok op ijs af tot kamertemperatuur of kouder. Centrifugeer de monsters vervolgens 15 minuten bij 10.000 RPM. Verwijder na centrifugatie het supernatant, waarbij u ervoor zorgt dat het pellet niet wordt verstoord en er geen materiaal van het pellet wordt verwijderd. Laat hiervoor ongeveer 150 microliter van het supernatant in de buis achter en was het pellet meerdere keren met water.

Voer vervolgens een hydrolyse uit met geconcentreerd zwavelzuur om het kristal en het cellulosepellet volledig te hydrolyseren tot glucose. Begin met het toevoegen van 175 µL 72% zwavelzuur aan de sarta-buis en incubeer dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vortex na de initiële incubatie het monster en incubeer dit nogmaals gedurende 15 minuten.

Voeg vervolgens 825 µL water toe en vortex en centrifugeer de monsters bij 10.000 RPM gedurende vijf minuten. Er kan wat bruin en oplosbaar materiaal, voornamelijk lignine, in de buis achterblijven, terwijl de glucose zich in het supernatant bevindt. Het glucosegehalte van het supernatant wordt bepaald met de colorimetrische anthron-analyse.

Deze assay wordt uitgevoerd in een polystyreen microtiterplaat met 96 putjes. Maak een glucose-standaardcurve in dubbeltoestandsmeting volgens de instructies in het bijbehorende schriftelijke protocol. Bereid de monsters voor door 10 µL van elk monster, supernatant en 90 µL water in afzonderlijke putjes van dezelfde microtiterplaat als de standaard te combineren; voltooi dit door 200 µL vers bereageerd reagens toe te voegen.

Verwarm de plaat vervolgens 30 minuten lang op 80 °C in een oven met een aluminium warmteverspreider. Let erop dat de glucosehoudende monsters van geel naar blauwgroen verkleuren wanneer het verwarmen voltooid is. Laat de plaat afkoelen tot kamertemperatuur en schud deze grondig.

Meet de absorptie bij 625 nanometer met een microtiterplaatlezer. De glucoseconcentratie, de bouwsteen van cellulose, wordt berekend op basis van de absorptie in vergelijking met de standaardcurve die op dezelfde plaat is vastgesteld. Hier volgen enkele representatieve resultaten van de polysacharideanalyse van een stuk populierenhout.

De pieken in het gaschromatogram worden geïdentificeerd aan de hand van massaprofielen en/of retentietijden van standaarden. De monosachariden worden gekwantificeerd op basis van standaardcurven. De suikeranalyse van de matrixpolysachariden toont een hoge overvloed aan xylose, wat wijst op hemicellulose-xam, maar er zijn ook andere suikers aanwezig.

Volgens de analyse bestaat 40% van het populierenmateriaal uit kristal en cellulose. Houd er rekening mee dat deze gehaltes en samenstellingen kunnen variëren van plant tot plant of tussen verschillende plantanatomieën. We hebben u zojuist laten zien hoe u het polysacharidegehalte en de samenstellingsanalyse van lignocellulosische biomassa bepaalt voor de analyse van polyfenollignine.

Kijk naar deel één. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.