Het belang van correcte eiwitconcentratie voor Kinetics en affiniteit Bepaling in structuur-functie analyse

Het algemene doel van dit video-artikel is om antwoorden te geven op de volgende twee vragen. Ten eerste, kunnen studies naar eiwitinteracties betrouwbaarder worden gemaakt door de fractie van een eiwitmonster te meten die daadwerkelijk in staat is om aan een ander eiwit te binden? Ten tweede, hoe kan kinetische analyse ons een beter inzicht geven in structuur-functierelaties?

Beide vragen zullen worden behandeld in een experiment met Corp X 100, een instrument dat proteïne-interacties in realtime detecteert zonder gebruik van labels. Dit experiment zal de interactie tussen bovine cystatine B en de cystineprotease papaïne onderzoeken; de kristalstructuur van de twee proteïnen in complex wijst op verschillende residuen die betrokken zijn bij de binding aan de protease, om te bepalen hoe elk van de interagerende residuen de interactie tussen cystatine B en papaïne beïnvloedt. Verschillende cystatine B-varianten worden geproduceerd via site-directed mutagenese.

Bij dergelijke experimenten bestaat altijd de mogelijkheid dat recombinante eiwitten niet correct vouwen, aggregeren of degraderen, wat leidt tot onjuiste en niet-reproduceerbare resultaten. De VIACORE X 100 is in staat om de fractie van het eiwit die beschikbaar is voor binding te bepalen middels kalibratievrije concentratieanalyse, afgekort als CFCA. Deze benadering maakt het mogelijk om de concentratie van het eiwit met behouden bindingsactiviteit te bepalen, zelfs wanneer kalibratiestandaarden niet beschikbaar zijn.

CFCA zal hier worden gebruikt om de concentratie van de cystatine B-varianten te bepalen. Deze gegevens worden vervolgens gebruikt als input bij de bepaling van de bindingskinetiek van de cystatine B-varianten aan Pepin, wat eveneens wordt beoordeeld met BOR X 100. Hallo, ik ben CLA gram van GE Healthcare in Zweden.

Vandaag zal mijn collega Eva Pool laten zien hoe u een structurele functieanalyse uitvoert met behulp van BOR X 100. Recombinante eiwitten kunnen na verloop van tijd een onjuiste vouwing of een verminderde bindingsactiviteit vertonen, en dit gedrag kan niet worden gedetecteerd met methoden die gebaseerd zijn op de meting van de totale concentratie. Dit kan in feite leiden tot onjuiste kinetische gegevens na de concentratiemetingen via kalibratievrije concentratieanalyse. B.A core X 100 wordt gebruikt om de kinetiek en affiniteit van de interactie van cystatine B-varianten met pepsine te analyseren.

Deze parameters zullen inzicht geven in het bindingsmechanisme. We beginnen met een korte uitleg over het experimentele ontwerp, dus laten we beginnen. De interactie tussen de cystine-protease papaine en de remmer cystatine B wordt gedomineerd door hydrofobe contacten, zoals blijkt uit de kristalstructuur van de twee eiwitten in complex.

Vanuit de zijde van de inhibitor zijn de contactgebieden de N- en C-terminale uiteinden en twee hairpin-loops. In deze studie worden vier mutanten onderzocht, waarbij in elke mutant cysteïne-mutaties zijn geïntroduceerd om dimerisatie van cystatine B te voorkomen. Op basis van de context uit de kristalstructuur werd leucine 73 gemuteerd naar glycine, histidine 75 naar glycine en tyrosine 97 werd veranderd in alanine. De twee glycine-mutaties werden geïntroduceerd om het belang van de histidine 75- en leucine 73-zijketens voor de binding aan Pepsin te onderzoeken; het tyrosine-residu werd gemuteerd naar alanine om de interactie tussen de C-terminus van cystatine B en Pepsin te onderzoeken.

De drie dubbele mutanten alsofals als INE drie naar Syrische enkelvoudige mutanten worden getest op hun interactie met een katalytisch inactieve variant van Papaine S methyl popin. Deze katalytisch inactieve vorm van de Proteus heeft een methylgroep gebonden aan CYS 25 in de actieve spleet. Omwille van de eenvoud zullen we deze variant in het gehele protocol propan noemen.

CFCA is gebaseerd op de meting van de bindingssnelheid onder omstandigheden waarbij de snelheid wordt beperkt door de diffusie van analytenmoleculen naar het oppervlak. Dit wordt bevorderd door hoge immobilisatieniveaus van het ligand. Plaats vóór aanvang van de immobilisatieprocedure de HEPs-buffer die in de experimenten wordt gebruikt op het linkerblad en steek beide slangetjes erin.

Plaats daarnaast een lege afvalfles op het rechterplateau. Plaats vervolgens een nieuwe sensor gypsum five in het instrument, initialiseer deze via de core X 100 software en klik op het startscherm op het item dock chip tool. Klik in de software op start doc.

Gebruik vervolgens de immobilisatie-wizard om de immobilisatie in te stellen door aminekoppeling aan sensor CM5 te kiezen. Klik vanaf het startscherm op de knop 'Overige opties' en selecteer vervolgens 'Wizards'. Er verschijnt een venster met de beschikbare wizards. Selecteer 'Immobilisatie' en klik daarna op de knop 'Nieuw' rechtsonder. Het eerste scherm van de immobilisatie-wizard verschijnt, waarbij aminekoppeling aan sensor CM5 de standaardinstelling is.

Vink het vakje onder flowcel twee aan om in flowcel twee te immobiliseren. Flowcel één blijft ongewijzigd om als referentieoppervlak te dienen vanuit de drie onderstaande opties. Vink het vakje 'specify contact time' aan; het rechterdoelniveau verandert nu in contacttijd. Specificeer een contacttijd van 900 seconds.

Voer vervolgens de immobilisatieparameters in onder capturing molecule/ligand solution. Voer papaïne in. Klik daarna op next.

Het volgende scherm toont de indeling van het monsterrek. Positie één is bedoeld voor ethanolamine, dat wordt gebruikt om de resterende actieve groepen te deactivated na de koppeling van het ligand papaine aan het chipoppervlak. Plaats de ethanolamine-oplossing op positie één en positie twee.

Plaats het ligand papaine; papaine wordt bewaard in een overmaat aan methylsulfaat en verdund tot 50 µg/mL in 10 mM natriumacetaatbuffer, pH 4,5. Reconstitueer de EDC- en NHS-koppelingreagentia uit de amine-koppelingkit met dubbel gedestilleerd water. Pipetteer 85 µL EDC in een vial. Sluit deze af en plaats deze op positie drie.

Gebruik hetzelfde volume voor NHS in positie vier. Let erop dat bestand vijf afgedekt en leeg moet zijn, zodat het instrument ED, C en NHS in dit bestand kan mengen. Vergeet ook niet om het wasbestand in positie H2O te vullen met vers gedeïoniseerd water.

Wanneer het rek is gevuld volgens het overzicht op het scherm, klikt u op 'load samples' en plaatst u het rek in het instrument. Zodra het rek is geplaatst, klikt u op 'next'. Voordat de run wordt gestart, wordt er een checklist getoond.

Zorg ervoor dat alle controlepunten zijn voldaan wanneer dat het geval is. De run wordt gestart door op de startknop te drukken. De run wordt gestart tijdens de immobilisatieprocedure.

Gegevens worden in real time verzameld. Eerst worden de koppelingsreagentia geïnjecteerd. Vervolgens wordt pape aan het chipoppervlak gekoppeld en de procedure wordt afgesloten met de deactivering van de resterende actieve esters.

Na afloop van de run vat een dialoogvenster het resultaat van de run samen. In dit venster wordt het immobilisatieniveau weergegeven. De volledige koppelingsprocedure moet resulteren in ongeveer 3000 RU geïmmobiliseerde papaine.

Zodra papain op de sensorkchip is geïmmobiliseerd, start u de CFCA-analyse door de cystatine B-mutantmonsters te verdunnen tot een totale concentratie van ongeveer 10 nanomolar in ten minste 300 microliters. Noteer de verdunningsfactor, aangezien we deze later in de assay-instelling zullen gebruiken. Begin met het openen van het dialoogvenster van de wizard, zoals beschreven in de vorige sectie in het concentratiegedeelte van de assay-map.

Selecteer 'calibration free' en kies vervolgens voor 'new'. Het eerste scherm van de wizard toont de injectiesequentie. De instellingen kunnen ongewijzigd blijven, aangezien hier een sensor chip CM5 en een aanpak via directe immobilisatie-assay worden gebruikt.

Klik in het volgende scherm op volgende. Laat de selectievakjes prime before run en run startup cycles aangevinkt. Laat daarnaast het standaard aantal startcycli ongewijzigd op drie staan.

Voer heaps buffer in bij het veld voor de naam van de oplossing. Klik vervolgens op volgende. Voer in het volgende scherm de naam van de regeneratie-oplossing in, namelijk 20 millimolair natriumhydroxide.

Laat de andere parameters ongewijzigd. Klik op 'volgende' om de voorbeeldtabel te bekijken. Stel de monsters in volgens de voorbeeldtabel.

Elke rij in de monstertabel resulteert in twee cycli. Eén met een stroomsnelheid van 10 µL per minuut en één met 100 µL per minuut. Start de run met een blanco.

Voer vervolgens de naam, de verdunningsfactor, de diffusiecoëfficiënt bij 20 °C en het molecuulgewicht in. Voor elke mutant kan de diffusiecoëfficiënt worden berekend met behulp van de webtool op de website van het product. Een link naar deze tool is beschikbaar in de support-navigator van de software.

Aangezien het wordt aanbevolen om elk monster en duplicaat te analyseren, kopieert u de gehele tabel vanaf de lege rij tot aan het laatste monster en plakt u deze onderaan de tabel. Klik op 'volgende' om door te gaan. Het volgende scherm toont het monsterrek.

Plaats de monsters en reagentia in het rek volgens de indeling die door de software wordt aangegeven. Laad het rek in het instrument door op de knop voor het laden van monsters te drukken. Klik vervolgens op volgende.

Na het laden van de monsters wordt een herinneringsscherm met een checklist weergegeven. Controleer of alles is afgevinkt en druk vervolgens op start. Gegevens worden in realtime verzameld tijdens de run.

Sluit het venster met de verzamelde gegevens zodra de run is voltooid. Let op dat er een nieuw resultaatitem in het hoofdvenster is verschenen. Selecteer dit nieuwe resultaatitem en klik op de knop om de concentraties op basis van de gegevens te berekenen.

Evalueer via core X 100. Start de evaluatiesoftware om alle verzamelde gegevens weer te geven; selecteer vanuit de werkbalk concentratieanalyse en vervolgens kalibratievrij uit het menu. Kies in het eerste venster de gegevens die in de analyse moeten worden opgenomen.

Scroll door de lijst en ga door de weergavelijst om de gegevens voor alle monsters te bekijken. Als u bepaalde gegevens wilt uitsluiten, verwijdert u het selectievinkje in de lijst. Klik op 'volgende' om de berekening te starten.

Het CFCA-interactiemodel wordt automatisch gefit op de experimentele gegevens; wanneer het fitten is voltooid, worden de resultaten voor elk monster in het resultaatvenster gerapporteerd. Loop door de fits voor elk monster door de overeenkomstige rij in de tabel te selecteren. De kolom met de naam gemeten concentratie toont de concentratie in het geanalyseerde monster.

De concentratie in de oorspronkelijke monstername wordt berekend met behulp van de eerder ingevoerde verdunningsfactor en wordt weergegeven in de kolom berekende concentratie; klik na voltooiing op finish om het resultaat op te slaan. Nu we de concentraties van de eiwitten uit de CFCA-analyse kennen, hebben we een uitstekende basis voor onze daaropvolgende kinetische metingen. Kinetische analyse zal ons nu helpen om het belang van sleutelaminozuurresiduen voor het bindingsmechanisme te begrijpen.

Laten we beginnen met de configuratie van de kinetische analyse. De kinetische analyse begint met het plaatsen van een nieuwe CM5-sensorschip in het instrument via het startscherm. Kies voor het aanmaken van een assay-workflow voor kinetische affiniteit.

In de linkerbovenhoek verschijnt een dialoogvenster waarin informatie over het ligand wordt ingevoerd. Voer de naam papain in het vak voor de ligandnaam in en kies een ander eiwit uit de lijst met soorttypen. Selecteer vervolgens immobilize ligand covalently using sensor chip CM five uit de twee gepresenteerde alternatieve methoden voor ligandbevestiging; de aanbevolen assay-workflow wordt nu aan de rechterkant van het venster schetsmatig weergegeven.

Het begint met een immobilisatiestap, gevolgd door een assay-stap. Druk op doorgaan om verder te gaan. Sla de assay-workflow op zoals gevraagd door een naam in te voeren en op opslaan te drukken.

De software geeft nu de workflow van de assay weer met knoppen die bij elke stap horen. De eerste stap onder de voorbereiding van het sensoroppervlak is het bepalen van een mobilisatie-pH. Aangezien deze pH bekend is, drukt u op "bekende waarde invoeren" in het dialoogvenster dat verschijnt.

Voer de buffernaam acetaat en pH 4,5 in en kies opslaan. De assay-workflow is nu bijgewerkt met een groen vinkje om aan te geven dat deze stap is voltooid. Het is nu tijd voor immobilisatie; druk op de run-knop in de immobilisatiestap.

Hiermee wordt dezelfde wizard geopend als die werd gebruikt voor propaan en immobilisatie voor de CFCA-analyse. De immobilisatie van papine voor kinetische analyse wordt hier op dezelfde manier ingesteld, behalve dat er een meer verdunde oplossing gedurende een kortere tijd wordt geïnjecteerd. Dit is om minder papine te immobiliseren om situaties te vermijden waarin de bindingsnelheden van de cystatine B-mutanten beperkt worden door diffusie, zodat kinetische gegevens onafhankelijk gemeten kunnen worden. Aangezien de naam van het ligand en de pH van de immobilisatie in eerdere stappen van de assay-workflow zijn ingevoerd, zijn deze hier beide vooraf ingesteld.

De enige vereiste aanpassing is een contacttijd van 50 seconden. De immobilisatie verloopt vervolgens zoals eerder beschreven. De verwachte binding na immobilisatie is 50 R ru.

Een groen vinkje naast de run-knop geeft aan dat de immobilisatie is voltooid. Voer vervolgens de regeneratieloesing in de workflow in bij de betreffende stap. Zoek de regeneratiecondities door in het dialoogvenster dat verschijnt op 'bekende waarden invoeren' te klikken.

Voer de regeneratieoplossing en de contacttijd in. Klik vervolgens op opslaan. Nu het ligand is geïmmobiliseerd en de regeneratiecondities zijn ingevoerd, is alles gereed om kinetische gegevens te genereren; druk in het vak voor de kinetische affinity-assay op de knop start om de eerste stap van de kinetiek uit te voeren.

De Affinity wizard schetst de injectievolgorde van elke cyclus voor kinetiek met een enkele cyclus, wat hier wordt gebruikt; er is geen reden om iets te wijzigen. Klik op volgende om door te gaan. Houd in de volgende stap de standaardinstellingen aan die aangeven dat het systeem vóór de run moet worden geprimed.

Kies ervoor om één opstartcyclus uit te voeren om het chipoppervlak te equilibreren. Definieer vervolgens de injectieparameters voor het monster. Aangezien de regeneratieoplossing eerder is gespecificeerd en de instelling is vooraf gedefinieerd, is het niet nodig om enige van de parameters op het scherm te wijzigen.

Klik op volgende. Specificeer tot slot de monsters. Voer voor elke mutantvariant twee rijen in: één blanco en één met monster.

Een blanco cyclus wordt aangegeven door de parameter voor de hoogste concentratie op nul in te stellen. Er kunnen twee Cystatine B-varianten per run worden ingevoerd. Voer voor elke mutant het molecuulgewicht, de hoogste concentratie en de verdunningsfactor in en druk op volgende.

Op het volgende scherm is het monsterrek aangegeven. Bereid een verdunningsreeks van de eiwitmonsters voor en plaats de vials met doppen in het rek. Zoals op het scherm is aangegeven, wordt een vial met buffer in positie 13 geplaatst en een vial met de regeneratieloplossing in positie 14. Zorg ervoor dat de waterpositie met vers water wordt gevuld.

Plaats het rek in het apparaat en laad de monsters door op de knop voor het laden van monsters te drukken en vervolgens op volgende te klikken. Voer, zoals eerder gedaan, een laatste controle uit voordat u overgaat tot het uitvoeren van het experiment door op start te drukken; de interactiegegevens verschijnen in realtime. Wanneer de run is voltooid, gaat u onmiddellijk over tot het analyseren van de overige cystatin B-varianten volgens de zojuist gedemonstreerde procedure.

Als de overgebleven cystatine B-varianten opeenvolgend worden uitgevoerd, kan de prime-stap en de startcyclus worden weggelaten door de overeenkomstige selectievakjes in de stap uit te vinken. Wanneer elke run is voltooid, kan de data via de link worden geraadpleegd. Alle resultaten bevinden zich in de workflow van de assay.

Er verschijnt een dialoogvenster met alle resultaten die binnen deze workflow zijn gegenereerd. Om de kinetische snelheidsconstanten te berekenen, selecteert u het te evalueren resultaat en drukt u op evaluate; de core X 100-evaluatiesoftware wordt opnieuw gestart en toont alle verzamelde gegevens. Selecteer kinetics affinity in het menu van de werkbalk.

In het eerste scherm wordt de cysteïne drie naar Serine-mutant geselecteerd voor evaluatie. De gegevens van deze mutant worden weergegeven samen met de blanco meting die voor deze mutant is uitgevoerd; ga verder door op Next te klikken. Het volgende scherm toont de gegevens waarbij de blanco meting van de meting met monster is afgetrokken.

Kies voor het evalueren van de kinetiek door op de knop 'kinetics' te klikken. Kies vervolgens om de gegevens te fitten aan een one-to-one interactiemodel. Door op de knop 'fit' te klikken, wordt de fit op het scherm weergegeven terwijl deze wordt berekend.

Zodra het klaar is, worden de kwaliteitscontroles automatisch toegepast en onderaan gemarkeerd. Loop de kwaliteitscontrole-items na en bekijk vervolgens de sensorgramdata om er zeker van te zijn dat de sensorgrams voldoende kromming vertonen. Bekijk daarnaast de residuplot die de verschillen tussen de verzamelde gegevens en het gefitte model weergeeft.

Let op systematische en niet-willekeurige afwijkingen. Deze fit is acceptabel. Bekijk nu de kinetische gegevens in het tabblad rapport.

De associatiesnelheidsconstante, de dissociatiesnelheidsconstante en de equilibriumdissociatieconstante. Wanneer dit is voltooid, druk op finish en herhaal dezelfde procedure voor alle andere mutanten. Hier zijn representatieve resultaten van de CFCA-analyse voor de verschillende onderzochte cystatine B-varianten.

De gegevens van de specifieke bindingsconcentratie zijn geëxtraheerd uit de sensogrammen die zijn verkregen bij stroomsnelheden van 10 en 100 microliters per minuut. Bij het vergelijken van de concentratie bepaald door een two 80-meting met die bepaald door CFCA, is duidelijk dat terwijl het eiwit in de meeste gevallen volledig actief is voor de leucine 73 glycine-variant, de fractie actieve eiwit zeer laag is. De kinetiek van de binding van cystatine B-varianten aan pepsine wordt bepaald met behulp van single-cycle kinetiek.

De sensorgrammen tonen blanco- en referentie-gesubtraheerde gegevens met daaroverheen in het zwart de kinetiek voor een één-op-één interactiemodel. De specifieke bindingsconcentratie gemeten door CFCA voor de leucine 73 variant is slechts ongeveer 10% van de totale proteïneconcentratie zoals bepaald door een twee 80 meting. Wanneer de juiste concentratie wordt gebruikt bij het berekenen van de kinetische parameters, blijkt dat de associatiesnelheid voor leucine 73 vergelijkbaar is met die van de andere varianten.

Hoewel de associatiesnelheden van de mutanten vergelijkbaar zijn met die van het wildtype-eiwit, kan de dissociatiesnelheidsconstante van de mutanten bijna twee grootteordes hoger liggen, met een overeenkomstige toename van de equilibriumdissociatieconstante. De verminderde affiniteit is hoofdzakelijk afhankelijk van verhoogde dissociatiesnelheden, wat aangeeft dat zowel de tweede bindingslus als het C-terminale uiteinde van cystatine B bijdragen aan de bindingsaffiniteit door de inhibitor aan het enzym gebonden te houden zodra het complex is gevormd. Het gebruik van kalibratievrije concentratieanalyse was essentieel voor deze conclusie, omdat één van de mutanten een zeer lage bindingsactiviteit bleek te hebben. Mijn collega Pol heeft u nu laten zien hoe u de Biacore X 100 gebruikt in een gestructureerde functionele studie. Bij het uitvoeren van deze experimenten is het belangrijk om te onthouden dat, hoewel zowel de concentratie- als de kinetische analyse gebaseerd zijn op dezelfde bindingsprocedure, de experimentele condities vrij verschillend zijn.