Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Het algemene doel van het volgende experiment is om grote eiwitcomplexen te karakteriseren met behulp van structurele massaspectrometrie. Dit wordt bereikt door goudgeplate capillairen voor nano-flow electrospray-ionisatie voor te bereiden. In een tweede stap wordt het monster klaargemaakt en wordt de massaspectrometer gekalibreerd voor metingen van hoge massa.

Vervolgens worden de experimentele condities geoptimaliseerd om eiwitcomplexen intact te houden in de gasfase. Daarna worden MS- en tandem-MS-spectra opgenomen. De MS-spectra vertoonden ladingstoestanden die qua massa overeenkwamen met het intacte complex, terwijl tandem-MS-experimenten associatiepatronen van monomeren en gestripte complexen opleverden.

Hallo, ik ben Naam Kiba van het laboratorium van Miron aan het Whiteman Institute of Science, en ik ben Isaac Ky. Ik kom ook uit het laboratorium van michelon. Vandaag willen we u de basisprocedure laten zien voor het analyseren van grote eiwitcomplexen door middel van structurele spectrometrie. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om eiwitcomplexen te karakteriseren en om hun globale geometrie, samenstelling en interactienetwerken te definiëren. Laten we beginnen.

De analyse van niet-stroomgebonden eiwitcomplexen wordt uitgevoerd met de air spray immunisatie-techniek met behulp van emme plus of qua capillaren. Deze capillairen kunnen worden uitgetrokken tot een fijne punt met een diameter van ongeveer één micron en vervolgens worden gecoat met een geleidend materiaal zoals goud. Deze capillairen zijn commercieel verkrijgbaar, zoals hier te zien is.

Het is echter veel kosteneffectiever in gebruik. De glazen capillairen, die gekoeld en gecoat kunnen worden tot ze klaar zijn voor gebruik, worden gekoeld op dit naaldkoelapparaat en gecoat op dit coatingapparaat. Om met deze procedure te beginnen, bevestigt u twee stroken van een dubbelzijdige plakstrip op de bodem van een Petrischaal, waarbij u de stroken twee centimeter uit elkaar houdt.

Plaats een glazen staaf in het midden van een van de kussentjes. Het kleefkussentje houdt de capillairen op hun plaats en de glazen staaf ondersteunt de geprepareerde capillairen en voorkomt dat de uiteinden van de capillairen breken. Er werden borosilicaatglas-capillairen gebruikt met een buitendiameter van 1 millimeter en een binnendiameter van 0,78 millimeter.

Plaats één capillair in de naald, klem het capillair voorzichtig vast en pas de positie aan zodat het in het midden van het verwarmingsfilament ligt. Draai de klemmen voorzichtig aan totdat de capillairen aan beide uiteinden stevig vastzitten. Trek het capillair uit met behulp van het hier getoonde vooraf gedefinieerde programma.

Houd er echter rekening mee dat het programmeren van de puller een proces van vallen en opstaan is. Totdat een acceptabele tipvorm is verkregen, levert elke getrokken haarbuis twee uiteindelijke gevormde haarbuisjes op. Verwijder de getrokken haarbuisjes uit het instrument en inspecteer de tips; gooi alle haarbuisjes weg die vervormd of gebroken zijn.

Gebruik stompe positioneerpincetten om de capillairen in de Petrischaal te plaatsen. De basis van de capillairen is bevestigd aan het plakstripje en het bovenste gedeelte rust op de glazen staaf, waarbij de punt naar boven wijst. Ga door met het trekken van de capillairen totdat de Petrischaal vol is.

Ongeveer 80 haarvaten passen in een schaal met een diameter van 10 centimeter. Coat vervolgens de haarvaten met goud. Plaats de plaat in de goud-sputtercoater.

Zorg ervoor dat de gastoevoer is gekozen volgens de instructies van de fabrikant en activeer een vooraf gedefinieerde coatingcyclus. De coating wordt drie tot zes keer herhaald totdat de capillairen gelijkmatig goudkleurig zijn. Zodra de capillairen gereed zijn, kan men overgaan tot het kalibreren van de massaspectrometer.

De meeste experimenten die met MultiPro-complexen worden uitgevoerd, worden verricht met een Electrospray quadruple time-of-flight massaspectrometer zoals deze. De invoer is afkomstig van Waters en is aangepast voor hoge massa's. Kalibreer de massaspectrometer met cesiumjodide voordat het eiwitmonster wordt geladen.

Bereid eerst een oplossing van 100 mg/mL cesium in gezuiverd water voor. Cesium wordt gebruikt voor kalibratie van hoge massa's, aangezien de enkelvoudig geladen zoutclusters een breed massabereik beslaan, van een massa-ladingsverhouding van 393 tot ruim boven de 10.000. Neem met stompe pincetten een gecoate capillair uit de petrischaal en breng 2 µL van de cesiumoplossing in de capillair aan.

Gebruik een tip die is geladen met een einor-gel. Schuif de oplossing naar de punt van de capillair, dit kan handmatig of met behulp van een spin-down adapter. Plaats de capillair in de capillairhouder en pas de positie aan zodat de punt ongeveer 10 millimeters van de rand van de houder bevindt.

Plaats de capillair onder een optische microscoop en gebruik scherpe pincetten van type AA om de tip bij te snijden. Het is belangrijk om te controleren of er geen luchtbellen in de capillair zitten die de stroom kunnen blokkeren en of de capillair niet verstopt is. Zorg er daarnaast voor dat de goudlaag niet van de capillair is afgesleten.

Zo ja, vervang dan de capillair of trim de punt en verwijder het ongecoate gedeelte. Sluit vervolgens de capillairhouder aan op de nano flow ESI-interface. Draai de XY, Z-tafel naar achteren om beschadiging van de capillair te voorkomen en duw de tafel in de geactiveerde positie.

De capillair moet op een afstand van 1 tot 10 millimeter van de conusopening worden geplaatst. Breng capillairspanning en een lage nanoflow-druk aan totdat de spray is gestart. Probeer vervolgens de nanoflow-druk tot een minimale waarde te verlagen.

Optimaliseer de signaalintensiteit door de positie van de XYZ-stage, de capillaire spanning, de nanostroomdruk en de desolvatatiegasstroom aan te passen. Om een breed massabereik van seizoensgebonden piekseries te detecteren, moeten de versnellingsspanningen worden geoptimaliseerd. De hier gebruikte parameters zijn een capillair van 1,3 tot 1,7 kilovolt, een samplecone van 80 tot 150 volt en een extractiecone van één tot drie volt om de transmissie van ionen met een hoge massa te optimaliseren, waarvoor milde desolvatatiecondities vereist zijn.

De tegendruk wordt in de eerste vacuümfase tussen de bron en de analyzer verhoogd naar vijf tot zes millibar. Om de tegendruk te verhogen, wordt de conductantie van de vacuümlijn van de bron naar de scrollpomp voorzichtig verminderd door het isolatieventiel gedeeltelijk te sluiten, terwijl het effect op de signaalintensiteit wordt gemonitord. Wanneer de opstelling van de massaspectrometers is voltooid, worden ongeveer 30 scans verzameld met een snelheid van één scan per seconde bij een master charge ratio-bereik tussen 1000 en 15 000; kalibreer na de acquisitie de vluchttijd met behulp van de overeenkomstige kalibratietabel.

Nu de kalibratie is voltooid, kan het eiwitmonster worden geladen. Het monster wordt voorbereid vóór het kalibreren van de massaspectrometer, waarbij lage micromolaire concentraties vereist zijn. Concentreer het monster indien nodig met behulp van centrifugale ultrafiltratie-apparaten.

Verifieer dat het proteïnecomplex niet is geadsorbeerd aan het membraan van het apparaat vóór gebruik. Omdat alleen vluchtige oplossingen voor NESI kunnen worden gebruikt door het volume en de UV-absorbentie te controleren, is een bufferuitwisseling vaak noodzakelijk. Een microcentrifuge-gelfiltratiekolom kan worden gebruikt om alle sporen van zouten, buffermoleculen of andere niet-vluchtige adducten te verwijderen.

Suspendeer in plaats daarvan de monster. Een waterige ammoniumacetaatoplossing. Deze cruciale stap bepaalt de kwaliteit van de spectra.

Herhaal de bufferuitwisseling tot maximaal drie keer met minimale verdunning, minder dan een factor 1,3 per apparaat, totale maximale uitwisseling is bereikt. Indien zowel concentratie als bufferuitwisseling vereist zijn, kunnen deze gecombineerd worden uitgevoerd middels centrifugale ultrafiltratie, zoals zojuist aan het begin van deze sectie is getoond. Laad vervolgens het monster zoals beschreven voor de caesiumjodide-kalibratie en start het sproeien.

Begin met de initiële optimalisatie van de spray totdat het signaal wordt gedetecteerd. Gebruik de vergelijking voor de gemiddelde ladingsstaat waarin M de massa van het complex is. De exacte positie van de ladingsstaten is echter, uitgedrukt in Daltons, eiwitafhankelijk.

Om complexe dissociatie te voorkomen, mag de ijzerbron niet worden verhit. Schakel de verwarming uit of houd de temperatuur onder 40 °C. Varieer de positie van de capillair en de voltages van de samplecone en de extractor.

Om de ijzeroverdracht te maximaliseren, is een mogelijk startpunt de conusspanning van 100 volt, de extractorconusspanning van 1 volt en de capillairspanning van 1,5 kilovolt. Controleer de resulterende verandering in de spectra. Optimaliseer deze parameters in combinatie met een nanostroomdruk om de desolvatie te verbeteren en residueel water en buffercomponenten te verwijderen.

Verhoog de bias-spanning in de gasdruk in de botsingscel. Typische bias-spanningen liggen in het bereik van 10 tot 100 volt met een gasstroom in de val van 1 tot 10 milliliters per minuut. Voer dit zorgvuldig uit om associatie van het complex te voorkomen en pas de botsingsenergieën van de val en de overdracht aan.

Vaak zijn hogere spanningen, gewoonlijk in het bereik van 10 tot 30 volt, vereist voor de transmissie van ionen met een hoge massa. Op dit punt is het belangrijk om botsingsgeïnduceerde dissociatie van het complex te vermijden, zoals hier wordt getoond. Nadat een stabiel signaal is bereikt, wordt aanbevolen om de nanoflowdruk en de capillaire spanning te verlagen naar minimale waarden, terwijl een stabiele spray wordt behouden.

Nadat er verschillende scans zijn verzameld, gaat u over tot het identificeren van de componenten van het complex via tandem-massaspectrometrie. Zodra een optimaal en stabiel signaal voor het proteïnecomplex is verkregen, selecteert u een precursor-ion en stelt u het masscentrum in binnen de isolatiebreedte. Over het algemeen wordt een lage massaresolutie van 12 en een hoge massaresolutie tussen 13 en 15 gebruikt; gebruik eerst een breed massabereik om de dissociatieproducten met een hoge massa en lage lading te detecteren en verlaag dit vervolgens naar de gewenste waarden om de ms uit te voeren.

MS dissocieert de precursore IJzern door de botsingsenergie (afgekort als CE) en de druk in de botsingscel te verhogen. Verhoog de CE van de trap of transfer geleidelijk in stappen van 10 tot 20 volt en verhoog de druk van het botsingsgas naar 0 tot 5 ml/min. Monitor de veranderingen in de spectra totdat de optimale activatiecondities zijn bereikt. Een hoge activatie-energie kan de dissociatie van één of meer subeenheden uit het intacte complex induceren en de interactieaffiniteiten van verschillende subeenheden verduidelijken.

Selecteer meer dan één lading voor ms MS-analyse. In het geval van overlappende componenten helpt het verkrijgen van een set tandem MS-spectra bij het oplossen van de ladingsreeksen van de verschillende populaties. Bovendien dissocieren hogere ladaingstaten gemakkelijker in vergelijking met lagere ladingstaten; superponeer de MS en ms.

Ms-spectra om de isolatie van het gekozen precursor-ion te valideren. Naast de karakterisering van het intacte complex via MS en ms/ms, genereert MS kleinere subcomplexen in oplossing onder milde denaturerende omstandigheden; karakteriseer deze even tevoren.

De MS- en ms MS-analyse van subcomplexen vormen de basis voor het definiëren van de subunitarchitectuur van het complex. Voor de gedeeltelijke disruptie van subunit-subunit-interacties worden geleidelijk organische oplosmiddelen toegevoegd tot een concentratie van 50%, of wordt de pH van de oplossing gewijzigd door ammoniak of mierenzuur toe te voegen tot een concentratie van 4%. Ten slotte is het, om de massa's van de individuele subunits die het complex vormen te bepalen, belangrijk om spectra onder denaturerende condities te verkrijgen. Dit kan worden uitgevoerd met zip tip C four met een water-acetonitril-verhouding van 25 tot 75 en 1% mierenzuur als elutie-oplosmiddel. Verwerk en analyseer alle verzamelde gegevens en resultaten zoals gedetailleerd in het bijbehorende schriftelijke protocol. Voordat het eiwitcomplexmonster wordt geladen, zijn de massaspectrometers gekalibreerd met cesiumjodide.

De reeks gelijkmatig verdeelde pieken die in het rood zijn aangegeven, strekt zich uit over een breed bereik, van een hoofdladingsverhouding van 393 tot ruim boven de 10.000. Deze worden toegewezen aan enkelvoudig geladen zoutclusters met de algemene samenstelling van het caesium plus complex. Aanvullende signalen tussen de hoofdpieken, aangegeven in het zwart, worden veroorzaakt door dubbel en drievoudig geladen soorten uit de reeks caesium twee plus complex en het caesium drie plus complex.

Het verhogen van de druk in de eerste vacuümfase is essentieel voor het detecteren van clusters met een hoge massa. Het effect van druk op de pieken met een hoge massa wordt hier gedemonstreerd met drukmetingen van 1.2 en 5.3 millibar. Het massaspectrum voor de hogere druk wordt hier vergroot weergegeven.

Hier is een voorbeeld van massaspectrometrie van een lectinevariantcomplex, wat resulteert in een ladingstoestandsverdeling tussen een massa-ladingsverhouding van 3000 en 5,000. Echter, door een onvoldoende ontzilting van de ionen zijn de pieken breed. Het verhogen van de bias-spanning van vier volt naar 15 volt, wat leidt tot een toename in de versnellingscondities, veroorzaakt het verwijderen van resterend water en buffercomponenten, wat resulteert in een spectrum met een hoge resolutie; de gemeten massa komt overeen met een pentameer complex.

De ladingstoestand plus 15 werd vervolgens geselecteerd voor tandem MS-analyse. De toename van de botsingsenergie veroorzaakt de vrijgave van een sterk geladen monomeer gecentreerd op een massa-ladingsverhouding van 1.664 en een gestripte tetramere complex in het bereik van 5.000 tot 8.000 massa-ladingsverhouding. Het lectinvariantcomplex werd ook onder denaturerende omstandigheden onderzocht, wat leidde tot complexassociatie.

Op deze manier kan de exacte massa van de individuele subeenheden die het complex vormen, worden bepaald. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe MS- en tandem-MS-spectra van ionen met een hoge massa kunnen worden verkregen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om uw monster correct voor te bereiden en uitsluitend vluchtige buffers te gebruiken die compatibel zijn met massaspectrometrie.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.