Een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van Bacteriële Chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten

E Coli RP 4 37 worden geïntroduceerd in een chemotaxis-apparaat waar ze worden blootgesteld aan gedefinieerde ruimtelijke concentratiegradiënten. Cellen die de kamer binnengaan, komen terecht in het middelpunt van de concentratiegradiënt. Afhankelijk van of het signaal wordt waargenomen als een attractant of repellent, bewegen de bacteriën zich snel omhoog of omlaag in de concentratiegradiënt.

Hallo, ik ben Derek Engler van het Laboratory of Molecular Systems Biotechnology en de Department of Chemical Engineering aan de Texas A&M University. Vandaag laten we u een procedure zien om bacteriële chemotaxis te onderzoeken in een microfluïdisch apparaat. Wij gebruiken deze procedure in onze laboratoria om te bestuderen hoe E. coli RP 437 migreert in een concentratiegradiënt van nikkelsulfaat.

Laten we beginnen. De fluïdische laag en de controllaag worden vervaardigd door replica-gieten van Polymethyl SUBOXANE of PDMS vanaf de SU-8 master. Meng om met deze procedure de PDMS-prepolymeer en de crosslinker in een gewichtsverhouding van 10 op 1.

Ontgas het mengsel in een vacuümdroger gedurende één uur totdat de luchtbellen zijn verdwenen. Wanneer het PDMS-mengsel klaar is, plaats dan de SU-8 master in een Petrischaal en giet het mengsel voorzichtig over de SU-8 master tot de gewenste dikte. Verhit de Petrischaal met het PDMS en de SU-8 master-mal bij 80 °C gedurende twee uur om het PDMS te uitharden.

Verwijder na twee uur de uitgeharde PDMS-laag van de SU-8 master van de warmteplaat en pel de PDMS-mal van de SU-8 master af. De gewenste structuur bevindt zich nu in de PDMS-mal; pons met een stompgeëind naaldje (20 gauge) vier gaten in de PDMS-mal voor de slangverbindingen naar de gradiëntgenerator, de celingang en de celuitgang. Het PDMS-apparaat is nu klaar voor assemblage en bonding.

Reinig eerst een glazen microscoopglaasje met isopropanol en droog het met een Airstream. Stel vervolgens de PDMS-mal en het glazen glaasje ongeveer 30 seconden lang bloot aan zuurstofplasma in een plasma-etser. Breng de PDMS-mal in contact met het glazen glaasje. Verhit het contactglaasje en de PDMS-mal 15 minuten lang op 65 °C op een warmteplaat.

Om het PDMS-apparaat te assembleren, gebruikt u een scheermesje om de slang onder een hoek van 45 graden op de juiste lengte te snijden, afhankelijk van de configuratie van de microscoop. Steek vervolgens met een pincet één uiteinde van de slang in een van de vier in het apparaat geponste gaten.

Plaats een stompe naaldhub van 30 gauge in het andere uiteinde van de slang. Herhaal de plaatsing van de slang en de naaldhub voor alle overige gaten. Vul een spuit van 3 mL met één milliliter chemo taxes, buffer of CB.

Zorg ervoor dat alle lucht uit de spuit wordt verwijderd. Voeg CB toe aan de naaf van de uitlaatnaald met een pipet en tik tegen de naaf van de naald om eventuele luchtbellen te verwijderen. Druk een kleine hoeveelheid CB uit de punt van de spuit van 3 mL en verbind de spuit met de naaf van de naald zonder dat er lucht wordt ingesloten.

Duw CB door het apparaat totdat alle resterende naaldhubs gevuld zijn met CB. Dit zou het grootste deel van de luchtbellen moeten verwijderen. Vul vervolgens twee spuiten van 500 µL met CB dat de juiste concentraties bevat van de geteste chemo-effector.

Voorkom de vorming van luchtbellen door een klein druppeltje van de inhoud van de spuit uit te drukken, de druppels vloeistof in de naaldhouder aan te raken en de spuit te bevestigen om zeer beweeglijke bacteriën voor te bereiden. Kweek voor het chemotaxisexperiment een overnight-cultuur van e coli RP 4 37 met een GFP-expressieplasmid in triptonbouillon of TB bij 32 °C onder schudcondities tot de volgende dag. Gebruik de overnight-cultuur om een cultuur van 20 mL TB in een erlenmeyer van 250 mL te inoculeren tot een optische dichtheid bij 600 nm van ongeveer 0,05.

Kweek de cultuur bij 32 °C onder schudomstandigheden wanneer de cellen een OD 600 van ongeveer 0,35 tot 0,45 hebben bereikt. Oogst deze door middel van centrifugatie bij lage snelheid en resuspendeer de cellen tot een OD 600 van ongeveer 0,35 in CB dat de chemo-effector bevat in de concentratie die verwacht wordt in het midden van het kanaal. Voeg ten slotte RFP-gelabelde dode cellen met een OD 600 van ongeveer 0,35 toe aan de GFP-expresserende levende cellen.

Deze dode cellen dienen als interne controle om er zeker van te zijn dat eventuele migratie niet wordt veroorzaakt door stromeffecten. De celsuspensie is nu klaar om in het microfluïdische apparaat te worden geladen voor het chemotaxis-experiment. Om te beginnen met het chemotaxis-experiment, verwijdert u een deel van de CB uit de naaf van de celinlaatnaald en vult u deze bij met de celsuspensie.

Vul voorzichtig een spuit van 50 µL met de geresuspendeerde cellen. Doe dit langzaam, aangezien flagellen kunnen afscheuren, wat de motiliteit vermindert. Bevestig de spuit van 50 µL aan de aansluiting van de inlaatnaald, zoals eerder getoond, door een kleine druppel van de inhoud van de spuit naar buiten te duwen, deze druppel in contact te brengen met de vloeistof in de naaldaansluiting en de spuit vervolgens te bevestigen. Plaats het apparaat op de tafel van een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een hogesnelheidscamera voor beeldacquisitie.

Plaats beide inlaatspuiten in de spuitenpomp en start de doorstroming zodat de gradiënt wordt gevormd en de cellen door de slang stromen. Zodra de cellen de chemotaxiskamer binnengaan, wacht u ongeveer 20 minuten tot het systeem is gestabiliseerd. Verzamel vóór de beeldvorming fluorescentiebeelden van levende groene en dode rode cellen op verschillende locaties langs de lengte van de kamer.

Normaal gesproken verzamelen we 100 beelden per locatie met intervallen van drie seconden. De verkregen fluorescentiebeelden kunnen worden geanalyseerd met elk commercieel beschikbaar programma voor beeldanalyse, zoals Image J of metamorph, of met eenvoudige codes geschreven in matlab. In dit voorbeeld maken we gebruik van MATLAB-codes.

Begin met het verwijderen van de achtergrondpixels in de afbeelding door deze drempelwaarde voor pixelintensiteit in te stellen en verwijder alle pixels met een intensiteit die lager is dan de drempelwaarde. Dit minimaliseert ruis. Gebruik bij de analyse de positie van de dode cellen om het middelpunt van de afbeelding te bepalen.

Dit stelt de positie voor waar de cellen de chemotaxiskamer binnengingen en waar ze gedetecteerd zouden worden in de afwezigheid van migratie. Lokaliseer vervolgens de levende cellen in de afbeelding, verdeel de afbeelding in kanalen en bepaal het aantal levende cellen in elk kanaal. In ons eerdere werk werd de 10 50 µm brede chemotaxiskamer verdeeld in 64 kanalen die elk ongeveer 16 µm breed waren.

Nadat deze stappen voor alle afbeeldingen zijn herhaald, worden sommige van de totale celcounts voor elk kanaal over alle afbeeldingen verzameld. Dit geeft het totale aantal gedetecteerde cellen per kanaal over de duur van het experiment. Bereken de chemotaxis-partitiecoëfficiënt of CPC, die de migratierichting vertegenwoordigt.

Ken door de volgende stappen uit te voeren een vermenigvuldiger van plus één en minus één toe aan elke cel die zich respectievelijk aan de zijde met de hoge concentratie (rechts) of de zijde met de lage concentratie (links) van de dode cellen bevindt. Tel alle vermenigvuldigde waarden op en normaliseer deze naar het totale aantal gedetecteerde cellen. Bereken de chemotaxis-migratiecoëfficiënt, of CMC, die de migratie van cellen weegt op basis van de afgelegde afstand.

Een cel die zich verplaatst naar de positie met de hoogste concentratie in kanaal 64 krijgt een wegingsfactor van plus één, terwijl een cel die zich tot halverwege de zijde met de hogere concentratie verplaatst een wegingsfactor van plus 0,5 krijgt. Een cel die zich verplaatst naar de positie met de laagste concentratie wordt gewogen met minus één. De som van alle gewogen celaantallen wordt genormaliseerd naar het aantal cellen om de CMC te genereren.

Deze grafiek toont een lineaire concentratiegradiënt of een profiel dat in het microfluïdische apparaat is gevormd met behulp van fluoresceïne-isothiocyanaat. De vorming van een concentratiegradiënt wordt in deze figuur aangetoond met behulp van blauwe en gele kleurstoffen. De celinlaat was gesloten zodat er geen stroming doorheen was, en er is te zien dat er een reeks kleuren tussen blauw en geel wordt gevormd.

Hier zijn pseudokleurafbeeldingen van een representatief chemotaxisexperiment waarin E. coli RP 4 37 in het apparaat werd blootgesteld aan een gradiënt van 0 tot 100 micromol L-aspartaat of 0 tot 225 micromol nikkelsulfaat. De migratie van levende groene bacteriën naar L-aspartaat of weg van nikkel werd elke 2,5 seconden gedurende 30 minuten in beeld gebracht. Dode bacteriën, weergegeven in rood, dienden als controle voor stromeffecten in het apparaat.

De ruimtelijke verdeling van RP 4 37 in het microfluïdische apparaat in afwezigheid van een gradiënt wordt in deze grafiek getoond in vergelijking met de respons op een aspartaatgradiënt en een nikkelsulfaatgradiënt. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe de chemotaxis van e coli RP 4 37 in een gradiënt van nikkelsulfaat kan worden gemonitord. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat vortexen van de cellen tot een minimum moet worden beperkt, zodat een subpopulatie met een hoge mobiliteit kan worden gebruikt.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.