Een Gradient-genererende Microfluïdische Device for Cell Biology

Mijn naam is Jiang. Ik ben een postdoc-fellow bij Harvard en MIT Health, Science and Technology. En mijn naam is Amir Manchi en ik ben een bachelorstudent in het laboratorium van professor Hasane bij Harvard, MIT, division of Health Sciences and Technology.

Deze dia toont het schematische proces van de vervaardiging van het apparaat: eerst wordt SUA 50 opgestuurd via spin-coating op een siliciumwafers, waarna een masker op de siliciumwafer wordt geplaatst, gevolgd door UV-belichting en ontwikkeling. Hierdoor verkrijgen we deze pads op de siliciumwafer. Daarna kan het PDMS worden gegoten, gevolgd door uitharden en bakken, waarna kleine gaatjes worden geponst. Ten slotte kunnen we het apparaat hechten door middel van bonding tussen het PDMS-apparaat en het glasoppervlak met behulp van zuurstofplasma.

Oké, we zijn nu in de microfabricageruimte in het laboratorium en we gaan beginnen met het maken van enkele PDMS-lagen. Met PDMS bedoel ik de wetenschappelijke term polymethylsiloxaan, wat een organisch polymeer is. Het is het meest gebruikte organische polymeer op basis van silicium.

Het is in feite een mengsel van twee verschillende componenten: een siliconen elastomer basis en een siliconen elastomer uithardingsmiddel. De verhouding is 10 delen basis en één deel uithardingsmiddel. We hebben ongeveer 10 gram basis nodig en bijbehorend ongeveer één gram elastomer uithardingsmiddel; ik zal deze basis en het uithardingsmiddel nu met elkaar mengen.

Ik gebruik pipetten. Nu het mengsel klaar is, ga ik het daadwerkelijk op de siliciumwafer gieten. Het idee is dat deze siliciumwafers patronen aan de bovenzijde hebben.

Ze helpen deze PDMS-polymeer feitelijk om het patroon te verkrijgen en we gebruiken deze patronen om kanalen, groeven en of elk ander patroon te creëren dat we op deze polymeren nodig hebben. De volgende stap is, aangezien er veel bellen in dit mengsel zitten, dat we het in een vacuüm plaatsen om deze bellen in onze polymeer te voorkomen. Ik ga de PDMS-gels op de silicon wafer in de vacuümkamer plaatsen.

Ik ga de kamer sluiten en het vacuüm openen. Nadat de bellen verdwenen zijn, wat ongeveer een paar minuten duurt, plaatsen we het overnacht in de oven op ongeveer 70 °C, waardoor ze zullen stollen. Het patroon waar ik wil dat u op let, zijn deze drie verschillende reservoirs om gradiënten te maken, zodat we aan de ene kant een nulconcentratie hebben en aan deze kant een specifieke concentratie, waarbij we uniform in die richting bewegen; vervolgens maken we een klein gaatje aan het andere uiteinde, wat in dit geval onze uitlaat zal zijn.

De volgende stap is om een van deze patronen uit te snijden en over te brengen naar een petri-schaal, waarbij de patroonoppervlakken naar boven zijn gericht. Ik hoop dat u de drie inlaatkan en de ene uitlaat die ik u op deze patronen heb uitgelegd, kunt zien. We gebruiken kleine ponsen voor onze inlaat om polyethyleenslangen te kunnen gebruiken, en ik zal grote ponsen gebruiken voor mijn uitlaat om een reservoir te hebben.

We beginnen met de eerste inlaat. Ik maak een gat, hetzelfde doe ik bij de tweede, en vervolgens maak ik ook een klein gat voor de derde. De laatste stap is het maken van een groot gat bij de uitlaat.

Zodra we klaar zijn, hebben we een APDMS-laag, wat de bovenste laag is, en ik ga een andere glaslaag aan de onderzijde gebruiken. Deze microscopische glaasjes vormen de onderste laag van de microfluidische apparaten. We bevinden ons nu in de microfabricageruimte en ik heb één glaslaag en één PDMS-laag die ik aan elkaar wil bevestigen.

We gaan nu gebruikmaken van een apparaat dat een plasmareiniger wordt genoemd. Binnen in de kamer zorgt het plasma ervoor dat de zwakke oppervlaktebindingen worden afgebroken en vervangen door zeer reactieve chemische groepen, waardoor het oppervlak bovendien hydrofiel wordt. Ik neem nu de PDMS-mal, die de bovenlaag vormde en waarin enkele kanalen aanwezig waren, en ik verwijder de tape die ik eerder had aangebracht om te voorkomen dat er stof aan onze mal zou hechten.

Ik ga het in de kamer plaatsen. De volgende stap is dat ik een glaslaag heb, een microscoopglasplaatje, en dit wordt onze onderste laag in het apparaat. Dus ik ga deze ook in de kamer plaatsen.

Vervolgens sluit ik de kamer volledig. Zodra deze gesloten is, schakel ik eerst de stroom en daarna de pomp in; we moeten over ongeveer vijf minuten terugkomen bij deze machine. Wat ik nu ga doen, is de machine uitschakelen. Ik zet dus eerst de pomp uit, daarna de stroom, en vervolgens open ik de kamer.

Dit geluid wordt veroorzaakt door de negatieve druk die tijdens het proces in de kamer is aangebracht. Ik haal nu de verschillende lagen eruit om ze aan elkaar te bevestigen. Omdat het glas de onderste laag is, houd ik dit stevig vast in mijn linkerhand en plaats ik de PDMS-laag bovenop de glaslaag.

Omdat de patronen momenteel naar boven gericht zijn, zal ik de PDMS-laag omkeren. Ik plaats deze op het glas nadat ik ze tegen elkaar heb gedrukt. Ze hechten zeer gemakkelijk en een van de voordelen van dit plasmabehandelingsproces is de hechtsterkte en de permanentie.

Zo ziet het er aan het einde uit. Dus, nogmaals, dit zijn onze inlaatpoorten en dit is mijn uitlaatpoort, en we zijn klaar om door te gaan naar de volgende stap. De kweek vindt plaats in het apparaat, waarna het een uur in de incubator gaat. Na een uur wordt er een monster uit de incubator gehaald, waarna de viscultuur wordt toegevoegd en de oplossing wordt bereid.

Om de EGF-oplossing te maken, voegen we 15 ng/mL EGF en 10 µM Doxorubicine toe aan 2 mL cultuurmedium; deze oplossing wordt gebruikt om de EGF-gradiënt over het kanaal te visualiseren. Vervolgens nemen we 2 mL medium, virtueel medium, en voegen we hier nog eens 2 mL medium aan toe. Deze twee instellingen bevatten enkel normaal cultuurmedium voor infusie in het apparaat.

Ik verwijder dus de bel en maak opnieuw verbinding, maar er komt wederom een mobiele bel naar beneden. Vervolgens gebruik ik 15 nanogram EGF en 10 micromolair dextraan en 2 ml medium uit de reserve voor monster 2, plaats ik de spuit en verwijder ik de bel. Daarna voer ik een solution switch uit en schakel ik weer terug.

De oplossing wordt in de gasspuit getrokken en de zuiger wordt meerdere keren ingedrukt om luchtbellen te verwijderen; de oplossing van alle spuiten wordt eerst hierheen geleid, waarna de kraan wordt omgezet zodat de oplossing via de driewegkraan en de slang naar buiten stroomt. Nadat het mengsel uit de slang komt, kan de slang in het My Predict-apparaat worden geplaatst, waarbij alle drie de oplossingen gelijk zijn. De slang kan vervolgens voorzichtig worden aangesloten op de inlaat van het infusiekanaal.

Ten slotte zijn er twee: normale kweekmedia en kweekmedia met EGF, om het gradiëntprofiel van EGF te bevestigen. Dit is de cel in het net, de cel in het net.

Dit zal de uitlaat van de celkamer zijn, zodat een gradiënt kan worden gegenereerd via het drievoudige hubkanaal om vervolgens de gradiënt in het celgebied te creëren. Normaal gesproken is de procedure als volgt: we voeren de celplaatsing uit door de celsuspensie bij de uitlaat aan te brengen, waarna we voorzichtig kunnen afzuigen zodat de cellen door het celgebied stromen, automatisch worden geplaatst en neerslaan op de coating. Vervolgens controleren we of de cellen volledig zijn uitgespreid. Zodra is vastgesteld dat de cellen volledig zijn uitgespreid, kunnen we beginnen met de infusie om de celmigratie te bestuderen met behulp van het apparaat voor gradiëntgeneratie.