Het analyseren Reacties van Mouse Olfactorische sensorische neuronen Met behulp van de Air-fase Electroolfactogram opnemen

Een preparaat van het reukepitheel wordt op een schaaltje gemonteerd en in een stroom van bevochtigde lucht geplaatst. Onder een dissectiemicroscoop wordt een referentie-elektrode via een bufferoplossing elektrisch verbonden met het weefsel. Een registratie-elektrode wordt op het oppervlak van het reukepitheel geplaatst.

Het reukepitheel wordt gestimuleerd door computergestuurde geurstofstootjes die worden toegediend in een stroom bevochtigde lucht, die de geurstoffen naar het reukepitheel transporteert. EOG-signalen worden via een versterker en digitalisator naar de opnamecomputer verzonden. Hallo, ik ben Catherine Ciar van het Laboratory of Hygiene XO bij de Department of Biology van de Johns Hopkins University.

Vandaag laten we u een procedure zien voor het registreren van het elektro-olfactogram bij muizen. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de reacties van olfactorische sensorische neuronen op geuren te bestuderen. Laten we beginnen.

De registratieapparatuur bestaat uit een registreerelektrode, een referentie-elektrode, een luchttoevoerbuis, een objecttafel en een dissectiemicroscoop, die allen zijn bevestigd op een luchttafel binnen een kooi van Faraday. Micromanipulatoren worden gebruikt voor het plaatsen van de elektroden in de luchttoevoerbuis. Een continue luchtstroom wordt door gedestilleerd water geleid om de lucht te bevochtigen voordat deze door de luchttoevoerbuis en over het specimen stroomt.

Een kweekschaal van 60 millimeter gevuld met agar van zes tot acht millimeter dik wordt gebruikt als montageoppervlak voor het specimen. In de agar in de montageschaal worden een putje en een kanaal uitgespaard. Dit dient om de referentie-elektrode via een gemodificeerde Ringer-oplossing elektrisch met het specimen te verbinden.

De registreer- en referentie-elektroden zijn verbonden met een versterker. Signalen van de versterker worden naar een digitalisator en vervolgens naar een computer gestuurd. XI-grafieksoftware wordt gebruikt om het stimulatieprotocol te beheren, het signaal te registreren en de responsen te analyseren.

Een oscilloscoop is na de versterker aangesloten voor real-time monitoring van het elektrisch potentiaal tijdens het plaatsen van de registreerelektrode en tijdens de EOG-registraties. De toediening van de geurstofstimuli wordt aangestuurd door een pico spritzer, die is verbonden met dezelfde computer die wordt gebruikt voor signaalacquisitie vlak voor het toedienen van een geurstofstimulus.

De uitgang van de pico spritzer is verbonden met een geurstoffenflacon die vloeibare geurstoffen bevat. De flacon is vervolgens verbonden met de luchttoevoerbuis. Laten we nu bekijken hoe we elektroden voorbereiden voor registratie-experimenten.

De registratie-elektrode is een zilverchloride-draad in een uitgetrokken glazen capillair gevuld met gemodificeerde Ringer-oplossing. De referentie-elektrode is een zilverchloride-draad. Begin de preparatie van beide elektroden door een zilverdraad in de elektrodehouder te plaatsen.

Voor de registratie-elektrode moet één tot twee centimeter draad uit het uiteinde van de elektrodehouder steken. Voor de referentie-elektrode kan meer draad worden gelaten. Om de zilverchloridecoating aan te brengen, plaatst u de draad in 0,1 molar natriumchloride en verbindt u de elektrodehouder met de positieve pool van een 1,5 tot negen volt DC-stroombron.

De negatieve pool van de stroombron moet elektrisch verbonden worden met de 0,1 molar natriumchloride-oplossing. Laat de chloride-reactie 10 minuten duren om eventuele statische lading tussen de registratie- en referentie-elektrode te neutraliseren. Raak de elektroden kortstondig aan voordat u ze op het registratieapparaat plaatst.

Trek vervolgens een glazen capillair met een micropipet-trekker. De opening aan de punt van het capillair moet een diameter van ongeveer 5 tot 10 micron hebben. Gebruik een diamantstift om het stompe uiteinde van het capillair in te kerven en af te breken, zodat het capillair ongeveer twee centimeter langer is dan de zilverdraad.

Gebruik een butaantoorts om het gesneden uiteinde vlamte polijsten en smelt vervolgens 0,5% agros in een gemodificeerde ringer-oplossing. Gebruik een transferpipet om een kleine hoeveelheid gesmolten agro-oplossing in de punt van de elektrode te trekken met een spuit die is verhit en uitgetrokken om een lang, dun uiteinde te verkrijgen. Vul de uitgetrokken capillair voor ongeveer de helft.

Tik met de gemodificeerde ringeroplossing voorzichtig tegen de capillaire om eventuele luchtbellen te verwijderen. Bewaar de gevulde elektrode in de bewaarpot met een kleine hoeveelheid gemodificeerde ringeroplossing op de bodem tot aan het gebruik. Zodra een weefselmonster is voorbereid en klaar is voor de registratie, plaatst u een gevulde capillaire over de registratie-elektrodedraad met de elektroden gereed.

Laten we kijken naar een registratie-experiment om de weefselvoorbereiding voor de registratie te starten. Verwijder de huid boven de schedel van een geofferde muis en halveer de kop langs de middellijn; monteer één helft van de kop met de mediale zijde naar boven op de monteerschaal. Verwijder voorzichtig het septum om de turbinalia bloot te leggen.

Plaats de schaal met het gemonteerde weefsel op de registratietafel. Lijn de tafel zo uit dat de registratielocatie op de turbinalia gecentreerd is onder de microscoop. Zet nu de luchttank aan om bevochtigde lucht met een debiet van ongeveer 600 milliliters per minute naar het oppervlak van de turbinalia te leveren.

Positioneer de luchtoevoerbuis zodanig dat deze zich op ongeveer 10 millimeter afstand van de registratieplaats bevindt. Stel de versterker in op DC-modus, aangezien AC-versterking artefacten in het EOG-signaal zal veroorzaken. Registreer met een laagdoorlaatfilter van 1 kHz en een versterking van 100 x.

Bevestig nu de registratie- en referentie-elektroden op de micromanipulatoren. Breng de referentie-elektrode naar beneden in de put van de montageschaal en bedek deze met gemodificeerde ringer-oplossing, zodat er een elektrische verbinding met het weefsel ontstaat. Plaats de registratie-elektrode voorzichtig op het oppervlak van turbinaat twee B of drie.

De elektrode moet het oppervlak van het reukepitheel nauwelijks raken. Wanneer de elektrode in contact komt met het epitheel, zal er een rechte basislijn op de oscilloscoop verschijnen. Bevestig nu een flesje met geurstof aan de zijpoort van de luchttoevoerbuis op de computer.

Start een stimulatieprotocol. De bemonsteringssnelheid voor de gegevensverwerving moet 2 kHz of hoger zijn. De software zal een geurpuls triggeren en beginnen met opnemen.

Een typisch stimulatieprotocol kan bestaan uit een enkele gepaarde puls met een duur van 100 milliseconden, pulsen van 100 milliseconden gescheiden door een interval van één seconde, of een aanhoudende puls van tien seconden. Om adaptatie te minimaliseren, dient men één tot vijf minuten tussen de protocollen door te laten verstrijken na het toedienen van hoge geurconcentraties. Er kunnen geurresten in de buis achterblijven; spoel de luchtslang met 95% ethanol en laat deze drogen voordat u verdergaat met aanvullende weefselmonsters.

Axo graft-software biedt instrumenten voor het meten van cruciale parameters van het EOG-signaal. Dergelijke parameters omvatten de responsamplitude, latentie, tijd tot piek en tijdconstanten van beëindiging. Verschillende EOG-parameters zijn bijzonder nuttig voor het vergelijken van genormaliseerde responsen tussen muizen, waaronder de responsamplitude, de stijgtijd van de latentie, tijd tot piek en de tijdconstante van beëindiging.

Hier worden OGs van een muis getoond als reactie op stimulatie met toenemende concentraties vloeibaar amylacetaat. De zwarte lijn bovenaan geeft het tijdstip en de duur van de geurstimulatie aan. Hier zien we een dosis-responsrelatie, gemiddeld over vijf muizen; de foutenbalken zijn 95%betrouwbaarheidsintervallen.

Bij zeer hoge geurconcentraties wordt vaak een afname van de piekamplitude waargenomen. Een voorbeeld van een EOG in reactie op een gepaarde pulsstimulatie is getoond; een enkele korte puls geurstof veroorzaakt adaptatie die enkele seconden aanhoudt. Hier wordt een EOG getoond in reactie op 10 seconden aanhoudende stimulatie door een geurstof.

Het EOG vertoont desensitisatie tijdens continue presentatie van een odorant. We hebben zojuist laten zien hoe het elektrodofactorgram bij muizen kan worden geregistreerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de elektrode net op het oppervlak van het epitheel te plaatsen en de elektrode niet door het oppervlak heen te laten dringen.

Neem altijd opnames op van dezelfde zijde van de kop en vermijd wijzigingen aan de opstelling om variatie te minimaliseren. Houd het weefsel vochtig, maar zonder dat er vloeistofdruppels ontstaan; door het weefsel direct na dissectie onder de bevochtigende lucht te plaatsen, blijft het weefsel in de beste staat voor de opname. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.