Imaging Geur-Opgeroepen activiteiten in de muis bulbus olfactorius met behulp van optische reflectie en autofluorescentie Signalen
31 oktober 2011
Dit artikel geeft de protocollen van de intrinsieke optische signalen en flavoproteins autofluorescentie signalen beeldvorming in kaart geur-opgeroepen activiteiten op het oppervlak van het reukorgaan in muizen.
Het algemene doel van dit experiment is om geurevoked activiteiten aan het oppervlak van de bulbus olfactorius van muizen in kaart te brengen met behulp van intrinsieke optische signalen en flavoproteïne autofluorescentiesignalen of FAS-imaging, nadat de muis is geanestheseerd en de schedel is blootgelegd. Het bot boven de bulbus olfactorius wordt dunner gemaakt. Met de punt van een scalpelblad wordt een botlap getrokken en vervolgens verwijderd; er wordt een kamer van tandheelkundig cement gemaakt die het blootgelegde oppervlak van de bulbus olfactorius omringt.
Het wordt gevuld met ARO's en er wordt een dekglas bovenop deze preparatie geplaatst. Olfactorische kaarten worden sequentieel verkregen in dezelfde muis met behulp van intrinsieke optische signalen en FAS-imaging. Het imagen van andere opgewekte activiteiten in de olfactorische bol van de muis met behulp van optische reflectie- en autofluorescentiesignalen kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen over de ruimtelijke organisatie van glomeruli in de olfactorische bol. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals 2-deoxyglucose-imaging of fMRI, is dat het mogelijk maakt om opgewekte activiteiten vast te leggen met een ruimtelijke resolutie van een enkele glomerulus.
Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methoden in het begin van hun werk problemen ondervinden, omdat zowel de chirurgische als de instrumentele vaardigheden traag worden verworven. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel om de aandacht te vestigen op de cruciale stappen van de chirurgische en beeldvormingsprocedures. Knijp in de achterpoot van de muis om de anesthesie te bevestigen en verwijder het haar van de schedel met een trimmer.
Verwijder eventueel resterend haar van de huid met steriele gaasjes gedrenkt in gedestilleerd water. Plaats de muis in het stereotaxische frame zodanig dat de snuit in hetzelfde vlak ligt als de achterkant van de kop. Om de bulbus olfactorius horizontaal te positioneren, moeten de oor- en neusstaven stevig worden vastgezet om beweging te voorkomen.
Breng oogsalf aan in de ogen om uitdroging tijdens de beeldvorming te voorkomen en desinfecteer vervolgens het gebied van de hoofdhuid met Betadine met behulp van steriele scharen. Maak een incisie in de achterkant van de kop tussen de oren, snijd vervolgens aan beide zijden richting de basis van het oor en in anterieur-posterieure richting naar het voorhoofd langs de oogleden. Voltooi het verwijderen van de hoofdhuid door de huid op de snuit door te snijden.
Gebruik de neusstrip als gids. Plaats het dier onder een stereomicroscoop en gebruik een met fysiologische zoutoplossing gedrenkt wattenstaafje om het periost op de bovenkant van de schedel voorzichtig los te maken. Gebruik een pincet om het resterende weefsel te verwijderen en schraap het schedeloppervlak met een scalpel om een schone preparatie te waarborgen, zodat het gebied van de bulbus olfactorius gedurende het experiment vochtig blijft.
Plaats een stukje absorbeerbare gelatinespons, gedrenkt in gedestilleerd water, op het bot boven de bulbus olfactorius die tussen de ogen ligt. Verwijder de gelatinespons en begin met het voorzichtig afschrapen van het bot met een scalpelblad nummer 10. Houd een constante hoek van 45 graden aan tussen het blad en het bot en beweeg het blad van de oogleden naar de sagittale zijde van het gebied rond de bulbus.
Zorg ervoor dat er tijdens het verdunnen geen verticale druk op het bot wordt uitgeoefend en dat het bot boven de veneuze sinus niet wordt bekrast. Stop elke vijf minuten en plaats een gehydrateerde gelatinespons op het bot om het preparaat af te koelen. Veeg de schedel met de spons om botstof te verwijderen en veeg de punt van het scalpel periodiek af om deze schoon en scherp te houden.
Zet dit voort totdat de spongieuze botlaag of trabekel zichtbaar is. Wanneer de fijne vasculatuur van de bulbus olfactorius zichtbaar is, stop dan met het schrapen van het bot en gebruik de punt van een scalpel nr. 11 om een rechthoekig gebied rond de bulbus olfactorius uit te tekenen. Houd het venster binnen de begrenzing van de veneuze sinussen en ga verder met het schrapen van het bot binnen het rechthoekige gebied.
Wees uiterst voorzichtig met de diepte van de scalpelpunt om contact met het dura-oppervlak te vermijden. Om een indruk te krijgen van de dikte van het resterende bot, kan dit voorzichtig worden weggeduwd met de punt van een pincet. Als het bot onder druk buigt, kunt u overgaan naar de volgende stap.
Voeg een druppel zoutoplossing toe en gebruik de punt van het scalpel, horizontaal georiënteerd, om de botlap op te lichten. Verwijder de lap voorzichtig met een pincet om te voorkomen dat het resterende bot scheurt. Zodra het oppervlak van de bulbus olfactorius is blootgelegd, moet worden gecontroleerd op de afwezigheid van bloedingen of bloedvaten. Anastomose.
Veeg het gebied schoon met een gelatinespons gedrenkt in zoutoplossing. Om de bulbus olfactorius vochtig te houden, brengt u polyacrylaat-tandcement aan met een spuit met een 29 gauge naald om een reservoir op het bot rond het craniële venster te vormen. Plaats een druppel laagsmeltende agarose over de dura mater en plaats een steriel dekglas over het craniële venster voor beeldvorming.
Plaats het stereotaxische frame onder de stereomicroscoop met het schedervenster gecentreerd in het gezichtsveld en stel dit scherp om de haarvaten zichtbaar te maken. Schakel over naar groen licht van 580 nanometer en leg een anatomisch controlebeeld vast om de staat van de preparatie tijdens de beeldvorming te controleren. Ga vervolgens over tot het vastleggen van de stimulatie-experimenten met behulp van intrinsic optical signal imaging onder 630 nanometers verlichting of flavoproteïne-autofluorescente signaalbeeldvorming onder 480 nanometers verlichting. Een standaard beeldvormingssessie omvat een basislijn van vijf tot 10 seconden waarbij alleen lucht wordt toegediend, gevolgd door de geurstimulatie gedurende drie tot 10 seconden, afhankelijk van de gekozen geurconcentratie.
Ten slotte wordt er een luchttoevoer van 70 tot 82 seconden vastgelegd voor de baseline-herstelperiode. Hierbij wordt de vatenstructuur van de bulbus olfactorius via het schedervenster in beeld gebracht, gevolgd door de resultaten van een stimulatie-experiment waarbij h sinal als odorant wordt gebruikt, vastgelegd met zowel iOS- als FAS-imaging. Bij de iOS-imaging wordt de door geuren opgewekte activiteit weergegeven als donkere absorptiegebieden; de door AL geactiveerde gebieden worden aangegeven door de witte pijlen, en actieve gebieden zijn zichtbaar in zowel enkele als gemiddelde meervoudige trials.
Bij het overschakelen naar FAS-beeldvorming in dezelfde muis wordt de opgewekte activiteit in de OD nu getoond als witte gebieden van autofluorescentie-emissie, aangewezen door de zwarte pijlen, en kan deze ook worden waargenomen in zowel enkele als gemiddelde meervoudige trials. Merk op dat zowel de zwarte absorptiezones die zichtbaar zijn bij iOS-beeldvorming als de witte gebieden van autofluorescentie-emissie die zichtbaar zijn bij FAS-beeldvorming, elkaar overlappen. Deze ruimtelijke overeenkomst bevestigt dat beide technieken de visualisatie van dezelfde olfactorische glomeruli mogelijk maken. Zodra de master-beeldvorming is ingesteld, kunnen opgewekte activiteiten met behulp van optische reflectantie- en autofluorescentiesignalen in één uur voor de chirurgie en een paar uur voor de beeldacquisitie worden uitgevoerd.
De belangrijkste nadelen van het gebruik van deze optische beeldgevingsmethoden zijn het feit dat ze niet kunnen worden toegepast om olfactorische kaarten te visualiseren in vrij bewegende muizen. En vanwege de beperkte penetratie van fotonen in biologische weefsels bieden ze geen toegang tot de ventrale olfactorische glomeruli na hun ontwikkeling in de late jaren negentig, bij het registreren van intrinsieke signalen in het olfactorische systeem. Misschien biedt dit een weg voor onderzoekers op het gebied van optische beeldvorming om de kenmerken van de speciale coating van od te onderzoeken.
Autofluorescentie-imaging van flavoproteïnen in de bulbus olfactorius is een veelbelovende techniek om nieuwe inzichten te verkrijgen in de specifieke coating van OD met behulp van endogene optische signalen.
Overzicht
Dit artikel presenteert protocollen voor het in beeld brengen van intrinsieke optische signalen en autofluorescentiesignalen van flavoproteïnen om geurevoked activiteiten op het oppervlak van de bulbus olfactorius bij muizen in kaart te brengen. De beschreven methoden maken resolutie-imaging van de activiteit in de bulbus olfactorius mogelijk, wat inzicht geeft in de neurale mechanismen van reuk.
Belangrijke componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Olfactorische verwerking
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van olfactorische verwerking is cruciaal voor inzichten in zintuiglijke perceptie.
- Beeldvormingstechnieken zoals intrinsieke optische signalen en flavoproteïne-autofluorescentie zijn waardevol voor het bestuderen van hersenactiviteit.
- Het in kaart brengen van geur-evoqueerde activiteiten kan de ruimtelijke organisatie van zintuiglijke reacties onthullen.
- Bestaande methoden missen mogelijk de resolutie die nodig is voor gedetailleerde analyse.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor het in kaart brengen van door geuren opgewekte activiteiten in de bulbus olfactorius.
- Het benutten van intrinsieke optische signalen en flavoproteïne-autofluorescentie voor beeldvorming met een hoge resolutie.
- Het aantonen van de voordelen van deze beeldvormingstechnieken ten opzichte van traditionele methoden.
Gebruikte methoden
- Muizen worden geanestheseerd en klaargemaakt voor beeldvorming door de bulbus olfactorius bloot te leggen.
- Het bot boven de bulbus olfactorius wordt dunner gemaakt om beeldvorming mogelijk te maken.
- Sequentiële beeldvorming legt reacties op geurstimulatie vast met behulp van zowel intrinsieke optische signalen als flavoproteïne-autofluorescentie.
- Beeldvormingssessies omvatten basismetingen en fasen van geurstimulatie om opgewekte activiteiten te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Geur-evoqueerde activiteiten worden gevisualiseerd als gebieden van absorptie en autofluorescentie.
- De resultaten tonen duidelijke activatiepatronen als reactie op verschillende geuren.
- Beide beeldvormingstechnieken bieden complementaire informatie over de activiteit van de bulbus olfactorius.
- Een hoge ruimtelijke resolutie maakt gedetailleerde mapping van sensorische responsen mogelijk.
Conclusies
- De ontwikkelde protocollen maken een effectieve mapping van de activiteit in de bulbus olfactorius mogelijk.
- Intrinsieke optische signalen en autofluorescentie van flavoproteïnen zijn krachtige instrumenten voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Deze methoden kunnen ons begrip van sensorische verwerking in de hersenen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Het in kaart brengen van geur-evoqueerde neurale activiteit in de bulbus olfactorius ondersteunt de validatie van targets bij de ontdekking van neurowetenschappelijke geneesmiddelen door de visualisatie mogelijk te maken van functionele neurale circuits die betrokken zijn bij sensorische verwerking. Deze aanpak biedt mechanistische risicovermindering voor verbindingen die zich richten op olfactorische paden of aanverwante neurologische aandoeningen door moleculaire interventies te koppelen aan meetbare veranderingen in neurale activatiepatronen. De techniek vergroot het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door een ziekterelevant systeem te bieden om de target-engagement en effecten op circuitniveau te beoordelen voorafgaand aan fenotypische screening.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door geur-geïnduceerde activatiepatronen in glomeruli te visualiseren als functionele modules van sensorische verwerking.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe observatie van de betrokkenheid van neurale circuits als reactie op sensorische stimuli.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door targetmodulatie te koppelen aan meetbare veranderingen in ruimtelijke activatiekaarten.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door baseline- en opgewekte activiteitsprofielen in de bulbus olfactorius vast te stellen.
- Operationele waarde: Pakt de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays aan via sequentiële beeldvorming van intrinsieke optische signalen en flavoproteïne-autofluorescentie onder gecontroleerde stimulatie.
- Schaalbaarheid: Benadrukt het hergebruik van het platform over verschillende stimulatietrials en odoranten om betrouwbare evaluatie van verbindingen in de sensorische neurowetenschappen mogelijk te maken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Bespreekt de relevantie voor ziekten door activatiepatronen van de bulbus olfactorius te koppelen aan sensorische verwerkingspaden die relevant zijn voor neurologische aandoeningen.
- Mechanische risicoreductie: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door neurale responsen in kaart te brengen die doelwitgestuurde veranderingen in de hersenactiviteit weerspiegelen.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Ondersteunt beslissingen door kwantitatieve ruimtelijke uitlezingen te bieden die correleren met functionele uitkomsten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetesten in de vroege ontdekkingsfase tot lead-identificatie en preklinische validatie, door read-outs van neurale activiteit te leveren die bijdragen aan de betrouwbaarheid van het target en het mechanistische begrip.
- Ontdekkingsbiologie: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing, pathway-verduidelijking en biologische risicoreductie ondersteunt door de door geuren opgewekte activatie in glomeruli te visualiseren.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid, reproduceerbaarheid en kwantitatieve resultaten via sequentiële baseline- en stimulatie-imaging met gebruik van 630 nm en 480 nm illuminatie.
- Analytica: Benadrukt metingen zoals veranderingen in absorptie (intrinsieke optische signalen) en autofluorescentie-emissie (flavoproteïne-signalen) die vergelijking van neurale activatie tussen verschillende condities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door activatiepatronen in de bulbus olfactorius te koppelen aan sensorische verwerkingspaden die relevant zijn voor therapeutische targeting.
- Bedrijfsmatige Herbruikbaarheid: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit voor longitudinale studies en cross-compound vergelijkingen binnen hetzelfde preparaat.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in sensorische verwerkingspaden.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van neurale activiteitsmapping over proeven en subjecten heen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium binnen neurowetenschappelijke programma's.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van neurale activatiedrempels en ruimtelijke patronen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in neurowetenschappen, chirurgische voorbereiding en optische beeldvormingstechnieken.
- Behoeften aan instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een stereotaxisch frame, stereomicroscoop, lichtbronnen op 580 nm, 630 nm en 480 nm, en systemen voor beeldacquisitie.
- Vereisten voor standaardisatie tussen teams voor chirurgische voorbereiding, anesthesiediepte en beeldvormingsparameters over verschillende laboratoria heen.
- Overwegingen voor adaptatie over modelsystemen, waarbij de huidige toepassing in de bulbus olfactorius van de muis wordt vermeld met potentieel voor uitbreiding naar andere sensorische regio's.
- Praktische beperkingen ondersteund door bronmateriaal: onvermogen om olfactorische kaarten te visualiseren in vrij bewegende muizen en beperkte fotonpenetratie die de toegang tot ventrale olfactorische glomeruli beperkt.
