Ontwikkeling van geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de zebravis chemische schermen.

In deze video wordt beeldgebaseerde high-content screening uitgevoerd om de modulatie door kleine moleculen van de fibroblast growth factor Rasm map kinase-signaleringsroute te beoordelen. In zebravisembryo's worden transgene mannelijke en wildtype vrouwelijke zebravisen gekoppeld in een kweekbak. Bevruchte eitjes vallen naar de bodem, worden verzameld en overgebracht naar een petrischaal. De embryo's worden gedurende de nacht geïncubeerd en vervolgens geplaatst in individuele putjes van een 96-wells plaat met ronde bodems.

Het kleine molecuul BCI wordt toegevoegd om FGF-signalering hyperactief te maken, waarna de plaat zes uur wordt geïncubeerd. Beelden van elk putje worden vastgelegd met een confocale plaatlezer en geanalyseerd met een zelfontworpen algoritme dat de fluorescentie-intensiteiten in specifieke embryonale structuren rapporteert. Hallo, ik ben Hiba Kado van het laboratorium van Dr. Michael Chang bij de afdeling Microbiologie en Moleculaire Genetica aan de Universiteit van Pittsburgh.

Hoi, ik ben Andrea Spock van het Drug Discovery Institute van de University of Pittsburgh. Vandaag laten we u de procedure zien voor het fokken, selecteren en in een array plaatsen van zebravisembryo's voor chemische behandeling. In een 96-wells plaat gebruiken we transgene embryo's die rapporteren over fibroblastgroeifactoractiviteiten en die behandeld zijn met een molecuul dat dit signaalpad hyperactiveert.

We laten u zien hoe we high-content screening-methodologie gebruiken om de activiteit van fibroblastgroeifactor in transgene zebravisembryo's automatisch te verwerven, te analyseren en te kwantificeren. Deze procedure belicht de platformtechnologie voor het gebruik van transgene zebravis en high-throughput chemische screens. Laten we beginnen.

Identificeer twee dagen vóór de behandeling homozygote mannelijke transgene zebravisjes en plaats deze in individuele paartanks. Plaats scheidingsschermen in de tanks, voeg vervolgens aan elke tank een wild-type vrouwtje toe en laat de vissen een nacht in de paarkooien staan bij 28 °C. Verwijder de volgende ochtend het scheidingsscherm. Verplaats de vissen na één uur naar een nieuwe tank en giet de embryo's in een plastic zeef.

Breng de embryo's over naar 100 millimeter petrischalen met E3-oplossing en incubeer ze bij 28 °C gedurende zes tot acht uur. Onderzoek na de incubatie de embryo's onder een stereomicroscoop. Embryo's die geschikt zijn voor experimenten, bevinden zich in het gastrulatiestadium.

Verwijder op dit moment alle onbevruchte embryo's, die in het eencellige stadium zullen blijven. Verwijder daarnaast niet-levensvatbare embryo's die ondoorzichtig of misvormd lijken. Voeg vervolgens verse E three-oplossing toe en incubeer dit gedurende de nacht bij 28 °C.

Plaats de embryo's de volgende dag onder een fluorescent stereomicroscoop om de transgene embryo's op basis van een vergelijkbaar stadium en uniformiteit te sorteren. GFP-expressie in embryo's van 24 HPF vertoont een zichtbare grens tussen midden- en achterhersenen met intense GFP-expressie en goed gevormde ogen met GFP-positieve dorsale retina's. Deze embryo's zijn actief en zullen met een plastic transferpipet bewegen en kronkelen in hun chorion.

Overbreng de embryo's van 24 HPF één voor één naar individuele putjes van een 96-wells plaat. Verwijder met een micropipet elk overschot aan E three-oplossing uit de putjes. Voeg vervolgens met een multichannel-pipetteur 200 µL E three-oplossing toe aan elk putje.

Voeg vervolgens twee microliters DMSO toe aan alle wells in kolom één en 12. Voeg daarna twee microliters BCL toe, bereid in DMSO, als volgt: één micromolar aan kolommen twee en zeven, vijf micromolar aan drie en acht, 10 micromolar aan vier en negen en 20 micromolar aan vijf en tien.

Voeg micromolair toe aan kolommen vijf en 10. En voeg tot slot 25 micromolair toe aan kolom zes en 11. Dek de plaat nu af met aluminiumfolie en incubeer deze gedurende zes uur bij 28 °C.

Voeg 10 µL trica toe aan elke put om de 30 HPF embryo's te anesthetiseren. Plaats de plaat vervolgens in de molecular devices image express ultra open meta express software. Kies een configuratie met een Forex-objectief en een maximale pinhole-diameter.

Configureer de automatische laserfocus om de bodem van de plaat te detecteren en gebruik een vooraf bepaalde optimale Z-offset. Om de regio's van belang te detecteren, stelt u het scangebied in als een enkele locatie van 2000 bij 2000 pixels zonder binning. Selecteer het juiste plaattype en de 488 nanometer argonlaser bij excitatiegolflengten van 488 over emissiegolflengten van 525 nanometer.

Select vervolgens een well met een met vehicle behandeld embryo en klik op 'find sample'. Het instrument voert een autofocus-scan uit en maakt één afbeelding om de juiste beeldacquisitie te bevestigen. Selecteer willekeurig een met vehicle behandelde well en maak een afbeelding.

Controleer of de afbeelding scherp is en GFP-expressie in de kop vertoont. Plaats de cursor over de helderste gebieden en verifieer of de fluorescentie-intensiteit binnen het bereik van de 16-bit camera ligt, namelijk minder dan 65 000 eenheden.

Herhaal deze stappen met een andere voertuigcontrole en enkele putjes die met het 화합물-complex zijn behandeld. Pas indien nodig het laservermogen en de gain aan, zodat de helderste regio's in de beelden van de positieve controle niet verzadigen. Kies vervolgens in het venster voor plaatacquisitie en -besturing voor 'acquire plate' om de plaatscan te starten.

Het instrument zal automatisch één afbeelding per well voor de gehele microplaat vastleggen en deze archiveren in een SQL-serverdatabase. Zodra het scannen is voltooid, uploadt u de afbeeldingen naar D definition's. Developer door developer te openen met de slinger-optie ingeschakeld.

Maak een nieuwe werkruimte aan. Selecteer vervolgens 'customized import' in het bestandmenu. Navigeer daarna naar de map waarin de afbeeldingen staan en open een voorbeeldbestand.

Kies een importfilter dat het afbeeldingsformaat en de bestandsstructuur herkent die zijn gegenereerd door het Molecular Devices ImageXpress Ultra-platform. Om de beelden te verwerken, opent u nu een controleafbeelding en laadt u de gewenste Cognition Network Technology (CNT)-algoritme of regelset. Het hier gebruikte aangepaste algoritme is ontworpen om automatisch het embryo, de dooier en de kop te identificeren en om de helderheid en het oppervlak van GFP-expresserende kopstructuren te kwantificeren; voer de regelset uit tot de fase van kop- en dooierdetectie.

Om een correcte toewijzing van de dooierzak en de kop te garanderen, dient de regelset te worden aangepast om de drempelwaarde voor de detectie van de dooier te wijzigen als de dooier te groot of te klein is. Voer vervolgens de regelset uit tot de fase van de detectie van heldere kopstructuren. Om een correcte toewijzing van GFP-expressiegebieden in de kop te garanderen, dient de regelset te worden aangepast om de drempelwaarde voor de detectie van kopstructuren te wijzigen als veelvouden van de minimale intensiteit, totdat de detectie van heldere kopstructuren overeenkomt met de visuele waarneming.

Voer vervolgens de volledige regelset handmatig uit op enkele willekeurig gekozen afbeeldingen van embryo's behandeld met het vehikel en positieve controle-afbeeldingen van embryo's behandeld met PCI. Om het algoritme op alle plaat-afbeeldingen uit te voeren, selecteert u de platen die geanalyseerd moeten worden en kiest u Analyse. Navigeer vervolgens naar de geoptimaliseerde regelset en analyseer alle wells.

Met behulp van de geïntegreerde taakplanner worden lege wells of ambigue beelden tijdens het scannen automatisch uitgesloten van de analyse. Er wordt een continu bijgewerkte keep-map weergegeven. Zowel de gegevens als de beelden zijn tijdens de run toegankelijk voor visuele inspectie.

De numerieke gegevens en bewerkte beelden worden automatisch opgeslagen. Nadat alle beelden zijn geanalyseerd, kunnen de gegevens worden geëxporteerd naar software van derden, zoals Excel, GraphPad of Prism. Deze figuur toont gearchiveerde scan-beelden van een met voertuig behandelde en een met BCI behandelde well, met en zonder CNT-analyse.

Toegepast groen fluorescerend eiwit of GFP wordt gedetecteerd in het oog, de grens tussen het midden- en achterbrein en de nervus trigeminus-ganglia van transgene embryo's. Let op dat zowel de GFP-intensiteit als de expressiedomeinen zijn uitgebreid. In de hier met BCI behandelde embryo's is een dosisafhankelijk effect van BCI op de expressie van het GFP-reportergen in transgene embryo's te zien.

De concentratie die nodig is om een halfmaximale respons op te wekken, of EC 50, was ongeveer 12 micromolar. We hebben zojuist aangetoond hoe u transgene zebravissen kunt fokken, de embryo's kunt verzamelen en deze in 96-wells platen kunt rangschikken. We hebben toenemende concentraties PCI toegevoegd als activator van de signaleringsroute.

We hebben ook aangetoond hoe de beeldvorming van transgene embryo's kan worden geautomatiseerd en hebben de beelden geanalyseerd met een op maat ontworpen algoritme op basis van cognitienetwerktechnologie. Met deze aanpak waren we in staat om op een graduele wijze kwantitatief de effecten van een klein-molecuulactivator van fibroblastgroeifactor-signalering te meten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om embryo's zorgvuldig te selecteren om de variabiliteit tussen specimens te minimaliseren.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.