Large Scale zebravis-Based In vivo Kleine Molecule Screen

Het algemene doel van het volgende experiment is het ontdekken van kleine moleculen die specifiek belangrijke aspecten van de embryonale ontwikkeling en fysiologie moduleren. Dit wordt bereikt door een groot aantal bevruchte eieren in 96-putjesplaten te plaatsen als tweede stap tijdens het screenen. Aliquoten van een bibliotheek met kleine moleculen worden toegevoegd aan de 96-putjesplaten met embryo's in de 96-putjes.

De wellplaten worden onderzocht op fenotypes die zijn opgewekt door de kleine moleculen. De resultaten tonen aan welke kleine moleculen specifiek de ontwikkeling of fysiologie van super fish beïnvloeden. Hallo, mijn naam is Charles Hong van de Vanderbilt University School of Medicine.

In ons laboratorium voeren we high-throughput chemische screenings uit met zebrafish-embryo's. Dit is een relatief eenvoudige techniek die breed kan worden aangepast om nieuwe bioactieve verbindingen te ontdekken. Richt op de middag vóór de dag van de chemische screening 10 tot 20 kweekbakken voor zebrafish in.

Plaats een scheidingswand in elk aquarium en vul elk aquarium met water uit het aquacultuursysteem; breng met een visnet één volwassen mannetje en één tot twee volwassen vrouwtjes over naar de binnencontainer. Label de kweekaquaria en plaats op de ochtend van de screening een deksel over deze aquaria. Verwijder de scheidingswanden uit de kweekaquaria om de zebravissen te laten paren.

Gedurende het volgende uur laat men de bevruchte eitjes door het rooster aan de onderkant van elke binnencontainer vallen. Keer de volwassen zebravissen na één uur terug naar de permanente opslagtanks.

Verwijder de binnencontainer en verzamel de eitjes door het water uit elk kweekreservoir door een plastic theezeef te gieten. Keer de zeef om boven een Petri-schaal en spoel de zeef voorzichtig af om de eitjes in de Petri-schaal te spoelen. Gebruik een spoelfles met E three medium om alle onbevruchte eitjes, die er opaak uitzien, te verwijderen.

Met behulp van een wegwerpplasticpipet zou elke paringskruising ongeveer 200 embryo's moeten opleveren. Draag vervolgens ongeveer vijf embryo's in E3-medium over naar elke put van een 96-wells plaat met een glazen Pasteurpipet. De embryo's zijn nu gerangschikt op een 96-wells plaat.

Verwijder met een 12-kanaals pipet zoveel mogelijk van het E three-medium uit de wells. Let erop dat de embryo's niet worden doorprikt. Breng met de 12-kanaals pipet 250 µL E three aan.

Voeg zo snel mogelijk medium met 0,5 µg/mL kanamycine toe aan elke well om te voorkomen dat de embryo's uitdrogen. Plaats de 96-wells platen in een incubator van 28,5 °C tot ze het gewenste stadium hebben bereikt waarop de verbindingen moeten worden toegevoegd. In dit protocol zoeken we naar verbindingen die de vroege embryonale patroonvorming verstoren en zullen we de embryo's drie uur lang incuberen, of totdat meer dan 90% van de embryo's het 1000-celstadium heeft bereikt; libraries met kleine moleculen worden gewoonlijk op deze manier geleverd.

In een bronplaat met 96 putjes, waarin elke verbinding is bewaard in DMSO als een voorraad van 10 millimolar, ontdooi ongeveer 60 minuten voordat de embryo's het gewenste stadium bereiken een 적당 aantal 96-putjesplaten met aliquoten van kleine moleculen. Noteer het serienummer of andere identificatienummer van de bronplaten om condensatie op de platen te minimaliseren. Plaats ze in een uitdroogkamer met een droogmiddel.

Centrifugeer de platen kort in een tafelcentrifuge die is uitgerust met een adapter voor multi-well platen. Verwijder de aluminium afdektape van de bronplaat en verdun de verbindingen in de bronplaat met DMSO tot de gewenste concentratie met behulp van een 12-kanaals pipet. In dit protocol gebruiken we een uiteindelijke concentratie van 0,5 millimolar en voegen we 4,75 microliters DMSO toe om de 10 millimolar stockplaat te verdunnen.

Wanneer de embryo's in de 96-wells plaat het gewenste stadium hebben bereikt, gebruik dan een 12-kanaals pipet om 2,5 µL van de verbindingen van de bronplaten over te brengen naar de ontvangstplaten met de embryo's. Dek de platen die nu de embryo's en verbindingen bevatten af met deksels en noteer het identificatienummer van de bronplaten op de embryo-platen. Meng de platen door ze voorzichtig te zwenken en plaats ze in een incubator van 28,5 °C.

Dek elke bronplaat met ongebruikte kleine moleculen af met aluminiumfolie, plak deze vast en plaats ze in een vriezer van -80 °C voor langdurige bewaring. Formuleer vóór het uitvoeren van de visuele screening een specifiek hit-criterium. Bijvoorbeeld, in een screening naar kleine molecuulremmers van brainin-ontwikkeling kan een hit een verbinding zijn die leidt tot het verlies van de voorhersenen.

De afwezigheid van ogen is een eenvoudige visuele indicator voor het verlies van de voorhersenen en vereist geen fluorescentie om op de gewenste tijdstippen tijdens de ontwikkeling te analyseren. Haal de 96-wells platen met de met verbindingen behandelde embryo's uit de incubator en onderzoek elke well onder een stereomicroscoop. Bij het screenen op kleine molecuulremmers van de ontwikkeling van de voorhersenen worden de platen na 28 uur gecontroleerd op het verlies van het oog als marker voor de remming van de ontwikkeling van de voorhersenen. Noteer de identiteit van de plaat en de locatie van de well voor elke well waarin ten minste drie van de vijf embryo's het voorgeschreven fenotype vertonen. Plaats de 96-wells plaat terug in de incubator.

Bevestig na 48 uur opnieuw het verlies van de ogen en de voorhersenen. Hoewel de embryo's geen voorhersenen zullen hebben, zullen ze ten minste vier dagen overleven. Bevestig een potentiële hit door de effecten van de verbinding bij verschillende doses opnieuw te testen; voor elke dosis worden 10 embryo's getest in 0,5 milliliters E3-medium in een 48-wellplaatformaat.

De timing van de verbinding-editie voor herbevestiging moet identiek zijn aan die van de oorspronkelijke screening. Een HIIT is bevestigd wanneer het opgewekte fenotype bij herbevestiging van de verbinding op een dosisafhankelijke manier wordt gereproduceerd. Identificeer ten slotte de hi-verbinding uit de database van kleine moleculen in de chemische bibliotheek.

Met behulp van de visuele chemische screening op basis van zebravis hebben we een kleine moleculaire hedgehog-signaalremmer ontdekt op basis van het effect ervan op de lichaamsas. Deze afbeelding toont embryo's die zijn blootgesteld aan de hedgehog-remmer en een duidelijke ventrale kromming van de staart vertonen. Dezelfde embryo's, die na 24 uur werden onderzocht en vervolgens na 48 uur, vertonen nog steeds het ventraal gekromde fenotype.

Deze afbeelding toont het met een verbinding behandelde embryo vergeleken met het embryo van een mutant in de hedgehog-signaalroute. Zodra deze techniek onder de knie is, kan één persoon in slechts enkele uren ongeveer 400 verbindingen per week screenen. Deze techniek heeft daarnaast de weg vrijgemaakt voor chemisch biologen om zaken te bestuderen zoals celontwikkeling, cel-signaleringsroutes en embryonale ontwikkeling.

Bij het werken met niet-gekarakteriseerde kleine moleculen is het belangrijk om de juiste veiligheidsmaatregelen te nemen en laboratoriumjassen en handschoenen te gebruiken, aangezien deze niet-gekarakteriseerde moleculen potentieel gevaarlijk kunnen zijn.