Experimentele Metastase Assay

Het algemene doel van het volgende experiment is om de metastatische eigenschappen van menselijke kankercellen te testen via injecties in de staartvin. De cellen worden voorbereid voor injectie in immuundeficiënte muizen. Vervolgens worden de cellen in de immuundeficiënte muizen geïnjecteerd, wat na één tot twee maanden zal leiden tot longmetastasen.

De muizen worden gedissecteerd en de longmetastasen worden gekwantificeerd en gekweekt. De resultaten van dit type assay geven de mate van metastasering aan van een specifiek type kankercel. Hallo, ik ben Sonali Mohanty van het laboratorium van Dr. LE in de afdeling Biomedische Genetica aan de University of Rochester.

Vandaag laten we u een procedure zien om een experimentele metastase-assay uit te voeren. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om kankermetastasering te bestuderen. Laten we beginnen.

Begin met cellen die zijn gegroeid tot ongeveer 70% confluentie; aspireer het medium uit de plaat en was deze voorzichtig één keer met 1X PBS. Voeg vervolgens twee milliliter 0,05% trypsine toe. Schud de plaat voorzichtig om de loslating van de cellen te vergemakkelijken.

Observeer de cellen onder een microscoop terwijl ze loslaten. Voeg een ruim volume medium met FBS toe om de activiteit van de tripsine te stoppen. Breng de cellen vervolgens over naar een buis van 50 milliliter.

Tel de cellen met een hemocytometer. Zodra de concentratie is bepaald, wordt er gecentrifugeerd bij ongeveer 200 ×g gedurende drie minuten zonder de celpellet te verstoren. Verwijder voorzichtig het medium en resuspendeer in een geschikt volume Hank's balanced salt solution of HBSS om een uiteindelijke concentratie van ongeveer 5 × 10⁶ cellen per milliliter te bereiken.

Filter vervolgens door een Falcon cellzeef van 70 micrometer. Om grote celaggregaten uit te sluiten, plaatst u de punt van de pipet direct op het filter, dat over een kweekbuis van vijf milliliter is geplaatst. Druk de suspensie snel door het filter in de buis.

Tel de cellen opnieuw met trypanblauw om de levensvatbaarheid te bepalen. De levensvatbaarheid moet groter zijn dan 90% voorafgaand aan de injectie. Verdun vervolgens tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 × 10⁶ cellen per milliliter.

Koel op ijs houden. Pak voorzichtig de staart van een immuundeficiënte muis vast en trek deze in de muisfixatiehouder, met de rug tegen de sleuf en de staart door de kleine opening aan de achterzijde. Schuif de ring langzaam langs de sleuf naar binnen.

Zodra de ring de bek van de muis vastgrijpt, wordt deze in positie vergrendeld. De muis mag zich niet vrij kunnen bewegen, maar moet wel een normale ademhalingsfrequentie behouden. Zoek de belangrijkste staartvenen.

In een muizenstaart zijn vier belangrijke bloedvaten aanwezig. De slagaders bevinden zich aan de dorsale en ventrale zijden van de staart. De aders bevinden zich aan de laterale zijden.

Zuig ten minste 200 µL van de voorbehandelde cellen op in een spuit van één milliliter. Bevestig een 30 gauge halve naald en druk eventuele luchtbellen uit. Het uiteindelijke volume in de spuit moet 200 µL zijn.

Bereid de injectie in het distale uiteinde van de staart voor. Indien de eerste poging mislukt, kan een meer proximale regio van de staart worden gebruikt voor een tweede poging. Trek de staart recht nadat de injectieplaats is afgenomen met 70% ethanol.

Houd de tip vast met de duim en ondersteun het injectiepunt met de wijsvinger. Voer de naald in de ader in en injecteer de cellen. Zorg ervoor dat de naald en de spuit tijdens de injectie parallel aan de ader lopen.

Anders zal de naald door de wand van het bloedvat prikken en zullen de cellen in het aangrenzende staartweefsel worden geïnjecteerd. Trek de naald terug als de procedure succesvol is verlopen. Bloed dient uit de injectieplaats te vloeien.

Druk een schoon wattenstaafje aan om het flossen te vergemakkelijken en palpeer de staart naar boven om eventuele resterende monsters in de circulatie te duwen. Laat de muis uit de fixatiehouder en plaats deze terug in de kooi. Noteer het aantal injectiepogingen en het aantal geïnjecteerde cellen in een laboratoriumnotitieboek.

Bepaal de levensvatbaarheid van de cellen na injectie. Zoals voorheen biedt deze stap de zekerheid dat de cellen gedurende het injectieproces in leven blijven. Aan het einde van een injectie-experiment zal de levensvatbaarheid van de cellen afnemen, maar deze moet boven de 80% blijven. Centrifugeer als optionele stap de overgebleven cellen en spoel de pellets één keer met PBS.

Bevries vervolgens de pellets bij -80 °C voor toekomstige analyses, zoals western blotting. Om de genexpressie bij knockdowns te bevestigen, worden de muizen na één tot twee maanden gedissekeerd om de locaties van metastasen vast te stellen. Begin hiermee door de geëuthanaseerde muis op een dissectiestation te plaatsen.

Sproei de muis royaal in met ethanol. Snijd de borstkas open om de longen en het hart bloot te leggen. Exciteer deze vervolgens zorgvuldig en plaats ze in PBS.

De long is de primaire locatie voor metastase, aangezien deze het eerste capillaire bed bevat waarmee cellen in aanraking komen. Nadat ze de circulatie zijn binnengegaan, verwijdert u het hart en spoelt u de longen met PBS, waarna u elke longlob onder een dissectiemicroscoop observeert. Tel het aantal detecteerbare metastasen aan beide zijden van de long en tel vervolgens het aantal longmetastasen op alle vier de lobben samen om het totale aantal longmetastasen te bepalen.

Isoleer vervolgens individuele longmetastasen door middel van excisie met een schaar. Breng elke metastase over naar een cellzeef van 70 micrometer en hak deze fijn met het uiteinde van een steriele naaldhoed. Spoel de cellzeef met enkele milliliters medium en verzamel de cellen die door het filter passeren.

In een kweekschaal, waarbij elke schaal de cellen van één metastase bevat. Incubeer de cellen gedurende ten minste vier dagen bij 37 °C zonder verstoring. Aanvankelijk zullen zowel kankercellen als fibroblastcellen op de platen groeien, maar geleidelijk zullen de fibroblastcellen afsterven en worden vervangen door kankercellen.

Indien de kankercellen drug-resistente genen bevatten, selecteer de cellen dan met de overeenkomstige antibiotica. Was na drie dagen eventuele bloed- of weefselresten op de schaal weg met PBS en voeg vers medium toe. Beoordeel de zuiverheid van de afgeleide cellen via immunokleuring met antilichamen tegen mensspecifieke eiwitten; hier wordt een anti-menselijk antilichaam gebruikt, zelfs in afwezigheid van drugselectie. Meer dan 99% van de cellen moet menselijk zijn.

De onlangs afgeleide cellen kunnen nu opnieuw worden geïnjecteerd in immuundeficiënte muizen om aan het einde van deze assay hun metastatische vermogens te testen. Een sterk metastatische kankercellijn leidt doorgaans tot veel longmetastasen, terwijl een zwak metastatische kankercellijn zeer weinig longmetastasen zal veroorzaken. Deze afbeeldingen tonen longmetastasen twee maanden na injectie van de humane melanomcellijn.

Een 3 7 5 sm. De cellen die met deze methode zijn verkregen, veroorzaken bij testen gewoonlijk meer metastasen dan de ouderlijn. Met gebruik van deze assay hebben we zojuist de procedure voor het uitvoeren van een experimentele metastase-assay gedemonstreerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het zeer belangrijk om ervoor te zorgen dat de cellen in de staartвена worden geïnjecteerd, en niet in het omliggende staartweefsel. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.