Immunocytochemische analyse van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een Self-Made Cytospin Apparatuur

Hallo, mijn naam is Rick Pasqua, student bij het Stem Cell Engineering Lab van de afdeling Chemical and Life Sciences aan de Virginia Commonwealth University. In deze video zal ik demonstreren hoe ons lab een goedkoop en zelfgemaakt STO-spinapparaat gebruikt om een waarneembare monocouche van humane pluripotente stamcellen te creëren voor de kwantificering van celoppervlaktemarkers. Aangezien veel immunochemische protocollen zijn aangepast voor hPSC's die als kolonies in kamerslides zijn gekweekt, kunnen er problemen ontstaan bij het karakteriseren van de expressie van biomarkers op het niveau van de individuele cel.

Het hebben van de cellen in een monolaag helpt niet alleen bij de visuele analyse hiervan, maar mogelijk ook bij het kwantificeren van hun expressie. Het sinus spin-apparaat dat onze laboratoria gebruiken, kan worden geconstrueerd met materialen die in de meeste laboratoria te vinden zijn, vereist slechts een klein celmonster en heeft geen specifiek reagens nodig. En nog belangrijker is dat het in staat is om betrouwbaar een spreiding van enkelvoudige cellen voor observatie te reproduceren. Hier zijn enkele van de zaken die u nodig heeft om het cytosine-apparaat te construeren.

Plastic objectglaasjes; aangezien deze niet noodzakelijkerwijs schoon hoeven te zijn, kunt u eventueel oude kamerglaasjes gebruiken. Voorgereinigde glazen objectglaasjes. Deze moeten worden gereinigd, omdat hier de cellaag zal worden aangelegd.

Filterpapier, elk type is geschikt, en micropipetpunten. Ons laboratorium gebruikt punten van 1 tot 10 µL voordat de constructie kan beginnen. Er moeten eerst gaten in de plastic objectglazen worden gemaakt.

Dit kan worden gedaan met behulp van een kolomboormachine. De diameter van de gaten is afhankelijk van de grootte van de micropipetpunt en moet ongeveer gelijk zijn aan de breedte van het breedste gedeelte van de punt die wordt gebruikt voor een standaard 1 tot 10 µL micropipetpunt. Dit moet rond de zeven millimeter liggen.

Het aantal gaten dat u in de plastic glaasjes maakt, is volledig afhankelijk van het beoogde gebruik ervan. Voor de immunochemische kleuring in ons laboratorium gebruiken we bijvoorbeeld meestal twee gaten, één voor de positieve kleuring en de andere voor de negatieve achtergrondcontrole. Deze glaasjes kunnen onbeperkt vaak worden hergebruikt.

Snijd voor het filterpapier eenvoudig een stuk uit volgens de afmetingen van het plastic objectglas. Gebruik de openingen van het objectglas als referentie voor het maken van openingen in het filterpapier. De grootte van de opening in het filterpapier moet groot genoeg zijn zodat de tip van de micropipet er nauwsluitend in past, zoals hier getoond.

Vervolgens moeten we het juiste aantal micropipetpunten afknippen, één voor elk gat, op ongeveer de helft van de lengte. Deze dienen als basis van het objectglas waar de cellulaire monolaag zal worden gecreëerd. Daarna wordt het filterpapier hierop geplaatst.

Het filterpapier dient om overtollig medium van de suspensiekleuring te absorberen. Dit wordt vervolgens afgedekt met het plastic objectglas, dat als stevige ondersteuning voor de apparatuur dient. Dit geheel kan vervolgens aan alle vier de zijden worden afgedicht met gewoon huishoudelijk plakband.

Ten slotte worden volledige micropipetpunten in de afgesneden punten van het apparaat geplaatst. Hierin worden de cellulaire monsters geplaatst na de suspensiekleuring. Het kan bovendien nuttig zijn om vooraf te markeren waar de afgesneden punten zich op het glazen objectglas bevinden voor een gemakkelijker herkenning.

Het protocol voor immunochemische suspensiekleuring dat ons laboratorium gebruikt, begint met het oogsten van stamcellen tot een enkelcel-suspensie, wat gewoonlijk gebeurt door enzymatische vertering met trypsine of via niet-enzymatische celdissociatiebuffers op basis van EDTA. De cellen worden vervolgens overgebracht naar microcentrifugebuisjes van 1 ml of 2 ml met hun standaard groeimedium. Deze worden daarna gecentrifugeerd bij 200 ×g gedurende vier minuten.

Dezelfde centrifugatiesnelheid wordt gebruikt voor alle volgende was- en centrifugatiestappen. Het medium wordt vervolgens handmatig afgezogen; wees extra voorzichtig bij het aspireren om ervoor te zorgen dat het celpellet ongestoord blijft. Dit wordt vervolgens twee keer gewassen met 1 ml PBS, waarbij elke keer wordt gecentrifugeerd en het supernatant wordt afgezogen.

De volgende stap omvat het fixeren van de cellen met 4% formaldehyde of PFA; de reagentia die hiervoor nodig zijn, staan vermeld in de bijbehorende beschrijving van deze video. De cellen worden geïncubeerd in de 4% formaldehyde-oplossing en 10 minuten bij kamertemperatuur gelaten. Het wordt aanbevolen om deze stap uit te voeren voorafgaand aan de extracellulaire suspensie en kleuring voor het gebruik van het cytospin-apparaat.

Daarna worden de cellen twee keer gewassen met PBS om resten PFA te verwijderen. De cellen moeten vervolgens worden geblokkeerd om aspecifieke kleuring te voorkomen. Zuig na de PBS-wassingen uit de vorige stap het wasmiddel af en voeg één ml van de blokkeringsoplossing toe.

Laat dit vervolgens ongeveer 45 minuten bij kamertemperatuur staan. Terwijl u wacht op de blokkeringsoplossing, kunt u het primaire antilichaam klaarmaken door het te verdunnen tot de aanbevolen verdunningsfactor in de blokkeringsoplossing. Bewaar dit bij vier graden Celsius.

Nadat de cellen ongeveer 45 minuten in de blokkeeroplossing hebben gezeten, worden deze gecentrifugeerd, waarna de vloeistof wordt afgezogen en de cellen opnieuw worden gesuspendeerd in de primaire antilichaamoplossing. Om aspecifieke binding en achtergrondruis te kunnen detecteren, is het raadzaam om ten minste één monster als negatieve controle te behouden. Hierbij wordt geen primair antilichaam toegevoegd en worden de cellen simpelweg opnieuw gesuspendeerd in PBS.

Alle monsters worden gedurende ongeveer één uur bij kamertemperatuur gelaten. Indien gewenst kunnen gefixeerde cellen overnight in suspensie in de primaire antilichaamoplossing worden gelaten en tweemaal worden gewassen met blokkeringsoplossing. De secundaire antilichaamoplossing kan worden bereid terwijl het wassen plaatsvindt.

Secundaire antilichamen zijn gewoonlijk lichtgevoelig; dim daarom indien mogelijk de laboratoriumverlichting en bedek alle gebruikte containers met aluminiumfolie om fluorescentie-bleaching te voorkomen. Antifa-reagentia kunnen in het protocol worden geïntegreerd, maar wees voorzichtig bij het gebruik ervan, omdat dit kan leiden tot een hogere achtergrond, net als wanneer het primaire antilichaam tot de aanbevolen concentratie in de blokkeringsoplossing wordt verdund. Breng na voltooiing van het wassen één vis aan op alle monsters, ongeacht of er primaire antilichamen aan zijn toegevoegd.

Laat dit ongeveer een uur staan op een donkere plek, bijvoorbeeld in een pot. Was de cellen twee keer met 1 ml blokkeringsoplossing. De cellen zouden nu klaar moeten zijn voor kernkleuring met DPI-kleurstof.

Bereid de DPI-oplossing in eerste instantie aan in PBS met een verdunning van 1:10.000, was de cellen één keer in 1 ml PBS, resuspendeer ze vervolgens in DPI en laat dit ongeveer 5 tot 10 minuten bij kamertemperatuur staan. Net als het secundaire antilichaam is DAPI lichtgevoelig, maak daarom de nodige aanpassingen om fluorescentie-bleking te voorkomen. Was één keer met 1 ml PBS en resuspendeer tot slot.

Resuspendeer opnieuw in 1 ml PBS. Dit moet vervolgens klaar zijn voor gebruik met een cytospin-apparaat. Plaats optimaal een maximum van 100 µL van de enkelcel-suspensie in de bovenkant van de micropipetpunten.

Een lagere hoeveelheid wordt echter aanbevolen om onnodige overloop of druppelen te voorkomen. Plaats vervolgens een cyto-spinapparaat en het contragewicht in een tafelcentrifuge en centrifugeer 4 minuten lang bij 1000 RPM. Monteer daarna voorzichtig het cyto-spinapparaat op een manier die de kans op het loslaten van de cellen van het glazen objectglas minimaliseert.

Verifieer onder een fluorescentiemicroscoop of er sedimentatie heeft plaatsgevonden voordat u overgaat tot het monteren. Dit zijn afbeeldingen van een monolaag BG one V-cellen, gekleurd met SSCA vier celoppervlaktemerkers uit het cyto-spinapparaat. Let op hoe geïsoleerd de cellen van elkaar zijn, waardoor observaties en registraties van individuele cellen mogelijk worden.

Het voordeel van dit protocol is dat het in staat is om een monocuallaag van cellen te reproduceren die haalbaar en kosteneffectief is, en eenvoudig aanpasbaar voor elke routineanalyse van stamcelculturen. Daarom hoop ik dat u deze video waardevol vindt en het protocol nuttig kunt toepassen in uw eigen onderzoek.