Analyse van de pluripotente stamcellen door gebruik te maken van vriescoupes Embryoid Bodies
8 december 2010
Pluripotente stamcellen in suspensie te groeien differentiëren in embryoid organen (EBS). Hier laten we zien hoe een hoge kwaliteit EB vriescoupes handig voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire aspecten van de embryogenese te verkrijgen, met behoud van hun organisatie als aggregaten.
Deel één, Introductie. Hallo, mijn naam is Rafael. Ik ben postdoc in het laboratorium van professor Stevens Hans aan de Federale Universiteit van Rio de Janeiro in Brazilië.
Hoi, mijn naam is Ismail. Ik ben onderzoeksassistent en tevens professor. In deze video laten we zien hoe u heldere coupes van Android-lichamen bereidt.
Laten we beginnen. Deel twee, materialen en apparatuur. Voor deze procedure hebben we een inbeddingsmedium voor bevroren specimens nodig.
4% Paraformaldehyde-oplossing voor fixatie van de cellen, sucrose-oplossingen voor cryoprotectie. Een naald met een licht gebogen punt, een stereomicroscoop voor betere visualisatie van de EBS en een shaker. Deel drie.
Hier worden de menselijke embryo-lichamen gekweekt in niet-adherente kweekplaten. Met behulp van een pipet groeperen we alle embryo-lichamen zo dicht mogelijk bij elkaar om ze over te brengen naar een conische buis van 15 milliliter. De EBS worden zorgvuldig geoogst en naar de buis overgebracht.
Het is belangrijk om alle ebs te verzamelen, aangezien er niet veel materiaal aanwezig is. Nadat de EBS zijn afgegoten, wordt het kweekmedium voorzichtig weggegooid. De pellet onderin de buis zou nu zichtbaar moeten zijn. We kunnen nu overgaan naar de fixatieprocedure.
EBS wordt gefixeerd in een 4% Paraformaldehyde-oplossing in PBS of fosfaatgebufferde zoutoplossing. Het is belangrijk om het pellet opnieuw te suspenderen met de PFA-oplossing. EBS worden vervolgens gedurende 30 minuten gefixeerd in de fixatieoplossing.
Na de fixatie wordt de PFA-oplossing voorzichtig verwijderd. Om te voorkomen dat de EBS opnieuw in suspensie raken, wordt deze vervangen door een 10% sucrose-oplossing in PBS om de cryoprotectie van de EBS te initiëren; het materiaal wordt gedurende 30 minuten in deze oplossing bewaard. Vervolgens verwijderen we voorzichtig de 10% sucrose-oplossing en resuspenderen we de EBS in een 20% sucrose-oplossing.
Vervolgens worden de EBS nogmaals 30 minuten in deze oplossing bewaard. Ten slotte wordt de 20%sucrose-oplossing verwijderd en vervangen door een 30%sucrose-oplossing in PBS, waarin ze nog 30 minuten blijven. Nu kunnen we overgaan naar de oriëntatie en het blokkeren van de EBS.
In ons laboratorium gebruiken we lege capsules als mallen. Voor het blokkeren van ebs is het belangrijk om de binnenwanden van de tip te coaten met een sucrose-oplossing voordat de ebs worden verzameld. Nu kunnen we de EBS zorgvuldig verzamelen en wachten tot ze naar de bodem van de tip zakken.
Vervolgens worden de EBS in het centrum van het blok geplaatst. Dit moet de uiteindelijke positie van de EBS in het blok zijn. Met behulp van een stereomicroscoop en een fijne tip verzamelen en verwijderen we zoveel mogelijk sucrose-oplossing.
Zorg er altijd voor dat de ebs niet worden verzameld. Met behulp van een naald met een licht gebogen punt worden alle EBS in het midden van het blok geplaatst. Ten slotte wordt de resterende sucrose-oplossing opgezogen met stukjes filterpapier.
De specifieke locatie van het EBS binnen het blok is zeer belangrijk voor het verkrijgen van coupes van goede kwaliteit. Hier is een voorbeeld van een slechte positionering van het EB binnen de huls. Na positionering van het EBS en verwijdering van de sucrose-oplossing wordt de huls vanaf de randen gevuld met OCT, waarbij er voortdurend zorg wordt gedragen dat het EBS niet door het Resus wordt gesuspendeerd.
De overgebleven bellen worden met een pipet verwijderd en de schelpen worden 15 minuten lang geschud. Na het schudden wordt het OCT-blok ingevroren in droogijs.
Op dit punt kunt u het blok, gewikkeld in aluminiumfolie, bij -80 °C bewaren voor verdere analyse of doorgaan naar deel vier van de cryostaat: het snijden. Voor het maken van de cryosneden heeft u een wegwerp- of permanent mesje, OCT en met poly-L-lysine voorbehandelde glazen objectglaasjes nodig. Het OCT-blok wordt uit de vriezer gehaald en in de cryostaat bewaard totdat het -20 °C heeft bereikt.
Het blok wordt vervolgens op de houder geplaatst en parallel aan de rand van het mes uitgelijnd. EB-monsters zijn veel kleiner dan de meeste andere weefselmonsters, dus het is zeer belangrijk om er zeker van te zijn dat het gehele oppervlak van het blok tegelijkertijd het mes raakt, om zo materiaalverlies te minimaliseren. Nadat het blok is gepositioneerd, wordt het gesneden in plakjes van 10 micrometer, die direct op de glazen objectglazen worden opgevangen.
De objectglazen kunnen worden bewaard, bij voorkeur bij -70 °C, of op dezelfde dag worden gebruikt. Het materiaal kan worden gekleurd voor immunohistochemie of immunofluorescentie. Conclusie. De hier beschreven methode biedt een redelijk goedkoop en eenvoudig te volgen protocol voor het verkrijgen van dunne cryostaatsneden van embryonale lichamen die zijn ontwikkeld uit zowel menselijke H9- als muis-USP1-stamcellijnen.
De resulterende cryosneden kunnen worden gebruikt in een breed scala aan procedures om de eiwitexpressie of de morfologie van de EB te analyseren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel demonstreert het proces voor het verkrijgen van hoogwaardige cryosecties van embryonale lichamen (EBs) afgeleid van pluripotente stamcellen die in suspensie zijn gekweekt. Deze cryosecties zijn essentieel voor het bestuderen van de cellulaire en moleculaire aspecten van embryogenese, terwijl de organisatie van de EBs behouden blijft.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Stamcelbiologie
- Embryogenese
- Cellulaire differentiatie
Achtergrond
- Pluripotente stamcellen kunnen differentiëren in verschillende celtypen.
- Embryonale lichamen zijn aggregaten die de vroege embryonale ontwikkeling nabootsen.
- Het bestuderen van EB's helpt bij het begrijpen van de mechanismen van embryogenese.
- Cryosneden van hoge kwaliteit zijn essentieel voor gedetailleerde analyse.
Doel van de studie
- Om een methode te bieden voor het bereiden van cryosecties van EB's.
- Om de bestudering van cellulaire en moleculaire processen tijdens differentiatie te vergemakkelijken.
- Om de structurele organisatie van EB's tijdens de analyse te behouden.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van pluripotente stamcellen in suspensiecultuur.
- Inductie van differentiatie tot embryonale lichamen (embryoid bodies).
- Cryosectietechnieken voor het verkrijgen van hoogwaardige monsters.
- Analyse van de cellulaire en moleculaire kenmerken van EBs.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle bereiding van cryosecties van EBs.
- Behoud van de organisatie van EBs in cryosecties.
- Verbeterde mogelijkheid om embryogenese op cellulair niveau te bestuderen.
- De gedemonstreerde methode kan worden toegepast in diverse onderzoekcontexten.
Conclusies
- De methode maakt een gedetailleerde analyse van EB's mogelijk.
- Hoogwaardige cryosneden zijn waardevol voor embryonale studies.
- Deze aanpak kan het begrip van stamceldifferentiatie bevorderen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de sector
Hoogwaardige cryosectie van embryoïde lichamen (EBs) afgeleid van pluripotente stamcellen maakt een nauwkeurige ruimtelijke analyse van differentiatiemarkers en weefselorganisatie mogelijk, wat vroege ontdekking en targetvalidatie in de regeneratieve geneeskunde en ontwikkelingsbiologie ondersteunt. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellend vertrouwen in op stamcellen gebaseerde modellen en informeert risico-gecorrigeerde beslissingen op cruciale beslismomenten in de discovery-pipeline. Betrouwbare EB-cryosecties faciliteren cross-functionele data-integratie voor de verdere ontwikkeling van de portfolio.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om de expressie van pluripotentie- en lineage-specifieke markers binnen driedimensionale EB-structuren te onderzoeken.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door differentiatiepaden en cellulaire heterogeniteit te verduidelijken.
- Biedt ruimtelijke context voor functionele targetvalidatie in systemen afgeleid van stamcellen.
Screening en assay-ontwikkeling
- Faciliteert de bereiding van gestandaardiseerde EB-cryosneden voor reproduceerbare immunofluorescentie- en in situ hybridisatie-assays.
- Maakt kwantitatieve beoordeling van de eiwit- en RNA-distributie over EB-secties mogelijk.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van assays en het hergebruik van platforms voor compound-screening in stamcelmodellen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro differentiatie uit in lijn met in vivo ontwikkelingsprocessen voor ziekterelevante modellering.
- Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie door de architectuur van EB's en de lokalisatie van markers te behouden.
- Biedt mechanistische inzichten die translationele biomarkerstrategieën informeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze cryosectie-methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege studies naar stamceldifferentiatie tot assayontwikkeling en validatie van preklinische modellen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot pluripotentie en lineage-commitment binnen EBs.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor markerexpressie en weefselorganisatie.
- Analytica: Maakt ruimtelijk opgeloste metingen mogelijk voor comparatieve analyse van differentiecondities.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en in vivo ontwikkelingsrelevantie wanneer dit wordt ondersteund door markerexpressiepatronen.
- Herbruikbaarheid op organisatieniveau: Vestigt een gestandaardiseerde workflow voor EB-analyse die toepasbaar is op meerdere stamcellijnen en differentieprotocollen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij stamceldifferentiatie en targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert het snijden van EB-secties voor reproduceerbare downstream-analyses.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door het leveren van robuuste spatiale en moleculaire gegevens.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van discovery-programma's op basis van stamcellen mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in cryosectie en het hanteren van delicate driedimensionale celaggregaten.
- Vereist toegang tot cryostaten, inbeddingsmedia en beeldvormingsinfrastructuur voor downstream-analyse.
- Vereist cross-team standaardisatie van EB-preparatie en sectieprotocollen.
- Aanpasbaar aan diverse pluripotente stamcellijnen en differentiatiemodellen, met aandacht voor de grootte en morfologie van de EB.
- Afhankelijk van zorgvuldige oriëntatie en inbedding om kwalitatief hoogwaardige, interpreteerbare secties te garanderen.
