Cel Electrofusion gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie
1 juli 2010
In deze video laten we zien efficiënte electrofusie van cellen In vitro Door middel van aangepaste naleving methode met behulp van elektroporatie en de daaropvolgende detectie van gefuseerde cellen visualisatie met fluorescentie microscopie.
Elektrofusie houdt in dat korte elektrische pulsen met een hoog voltage worden toegepast op cellen in nauw contact. In deze video demonstreren we in vitro elektrofusie van cellen via een aangepaste adherentiemethode. De experimenten werden uitgevoerd op muis-melanoomcellen, BF one.
Volg deze stappen voor het experiment. Kweek cellen in twee afzonderlijke kweekflessen tot 80% confluentie. Voeg vervolgens van elke stamoplossing 2.1 µL toe.
Voeg respectievelijk 10 millimolair C-M-F-D-A of CMRA toe aan drie milliliter Krebs Hess-buffer in een centrifugebuis. Spoel de cellen twee keer met Krebs Hess-buffer en voeg vervolgens de laadoplossingen toe aan de kolven. De laadoplossingen bevatten respectievelijk ongeveer zeven Micromolair C-M-F-D-A of CMRA.
Incubeer de cellen gedurende 30 minuten in een gecontroleerde atmosfeer. Tijdens deze eerste incubatie passeren reagentia vrijelijk door de celmembranen naar het cytosol, waar ze worden omgezet in membraan-IMP-permeante reactieproducten. Spoel de cellen na deze eerste incubatie af en incubeer ze vervolgens nog twee uur in kweekmedium.
De cellen worden geobserveerd met een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een gekoelde CCD-camera in de acquisitiesoftware. Stel de excitatiegolflengte in op 548 nanometer en kies een passend banddoorlaatfilter voor de fluorescentiebeelden van de cellen die zijn geladen met CMRA. Stel de excitatiegolflengte in op 492 nanometer en kies een banddoorlaatfilter voor de groene fluorescentiebeelden van de cellen die zijn geladen met C-M-F-D-A. Tel de cellen in beide kolven en meng de rode en groene cellen in een verhouding van één op één; stel de celconcentratie in op 5 miljoen cellen per milliliter.
Plaats een druppel van 20 µL cel-suspensie in het midden van elke well. Incubeer de cellen in een 24-wellplaat in een gecontroleerde atmosfeer gedurende 20 minuten, zodat de cellen zich licht kunnen hechten aan het oppervlak van de well in een monolaag en celcontacten tussen hen kunnen vormen. Plaats de multi-wellplaat met cellen op de microscooptafel.
Plaats de elektroden op de bodem van de put en sluit deze aan op de pulsgenerator. Om een optimale elektrofusie te bereiken en de levensvatbaarheid van de cellen te behouden, moeten adequate parameters voor de elektrische pulsen worden gebruikt. Deze parameters zijn afhankelijk van de cellijn en moeten in preliminaire experimenten worden bepaald. Verwijder het cultuurmedium en was de cellen met één milliliter ISO omu kaliumfosfaatbuffer bij 350 microliters hypos Miller kaliumfosfaatbuffer om celzwelling te induceren.
Laat de cellen twee minuten in de hyperosmale buffer rusten voordat de elektrische pulsen worden toegediend. De elektrische pulsen moeten worden toegediend wanneer de cellen dicht bij hun maximale volume zijn. Dat wil zeggen: voordat ze beginnen met het reguleren van hun volume.
Afname in ons experiment. Een reeks van acht rechthoekige pulsen met een duur van 100 microseconden bij één hertz werd toegepast. Na toediening van de pulsen.
Laat de cellen gedurende 10 minuten ongestoord rusten. Bepaal de diffusieopbrengst met behulp van fasecontrast- en fluorescentiemicroscopie. Neem drie beelden op: fasecontrast, rode fluorescentie en groene fluorescentie in vijf willekeurig gekozen gezichtsvelden.
In elk geval worden in de ImageJ-software drie kanaalbeelden gemaakt van elk beeldtriplet om de visuele kwaliteit van de beelden te verbeteren, waarna voorbewerkingsstappen zoals achtergrondsubtractie en contrastverbetering met standaardparameters op de oorspronkelijke beelden kunnen worden toegepast. Tot slot worden de drie kanaalbeelden samengevoegd met behulp van de RGB naar grijs-plugin van ImageJ. In een dergelijk beeld is het rustend cytoplasma samen met de celmembranen zichtbaar.
Op deze manier kunnen weinig cellen eenvoudig worden bepaald in de drie-kanaals afbeelding; tel alle drie de celtypen: rood, groen en dubbel fluorescent. Bepaal het percentage dubbel fluorescente cellen door het aantal dubbel fluorescente cellen te delen door het totaal aantal cellen in elke afbeelding. De fusieopbrengst wordt vervolgens gedefinieerd als het percentage dubbel fluorescente cellen vermenigvuldigd met twee.
Aangezien de helft van de view-cellen niet wordt gedetecteerd wanneer cellen van dezelfde kleur worden bekeken.
Overzicht
Deze video demonstreert de efficiënte electrofusie van cellen in vitro met behulp van een aangepaste adhesiemethode in combinatie met electroporatie. Het proces omvat de detectie van gefuseerde cellen via fluorescentiemicroscopie.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Cel Fusietechnieken
- Elektroporatiemethoden
- Toepassingen van fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Electrofusie is een techniek waarbij elektrische pulsen worden toegepast om cel-fusie te faciliteren.
- De methode kan de efficiëntie van het creëren van hybride cellen verhogen.
- Fluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van gefuseerde cellen mogelijk.
- Het begrijpen van cel-fusie is cruciaal voor diverse biologische toepassingen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode voor de electrofusie van cellen te demonstreren.
- Om de efficiëntie van de celfusie te visualiseren en te kwantificeren.
- Om een protocol te bieden dat in andere laboratoria gereproduceerd kan worden.
Gebruikte methoden
- Muis-melanoomcellen werden gekweekt en voorbereid voor fusie.
- Fluorescente kleurstoffen werden gebruikt om de cellen vóór de fusie te labelen.
- Elektrische pulsen werden toegepast om cel-fusie te induceren.
- Fluorescentiemicroscopie werd ingezet om de fusieresultaten te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle fusie van cellen werd aangetoond door middel van fluorescentie.
- Het percentage dubbel fluorescerende cellen werd berekend om de fusie-opbrengst te bepalen.
- Optimale parameters voor de elektrische puls werden geïdentificeerd voor de celviabiliteit.
- De visuele kwaliteit van de beelden werd verbeterd door middel van beeldverwerkingstechnieken.
Conclusies
- De gemodificeerde adhesiemethode is effectief voor cel-elektrofusie.
- Fluorescentiemicroscopie is een waardevol instrument voor het beoordelen van de fusie-efficiëntie.
- Dit protocol kan worden aangepast voor diverse celtypen in onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Cel-elektrofusie gevisualiseerd via fluorescentiemicroscopie biedt een niet-viraal en niet-chemisch platform voor het genereren van hybride cellen, wat onderzoek in de vroege fase van de biofarmaceutica ondersteunt. Kwantitatieve visualisatie van fusiegebeurtenissen maakt een robuuste beoordeling van celmanipulatietechnieken mogelijk, wat een directe impact heeft op targetvalidatie en assayontwikkeling. Deze benadering versterkt het voorspellende vertrouwen in celgebaseerde workflows en informeert risico-gecorrigeerde portfoliobeslissingen.
Strategische Toepassingen in Biofarma R&D
Vroege ontdekking en targetvalidatie
- Maakt directe bevraging mogelijk van cel-fusie-mechanismen die relevant zijn voor het testen van therapeutische hypothesen.
- Ondersteunt de functionele validatie van celmanipulatiestrategieën voor de generatie van hybride cellen.
- Faciliteert biologische risicoreductie door het kwantificeren van de fusie-efficiëntie en specificiteit.
- Biedt meetbare resultaten voor portfolio-triage en doelwitbetrouwbaarheid.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt gevalideerde cellsystemen vast voor downstream screening van fusie-afhankelijke fenotypes.
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare kwantificering van de fusie-opbrengst via duale fluorescentie.
- Maakt assay-schaalbaarheid en hergebruik van het platform mogelijk voor de evaluatie van verbindingen die gericht zijn op cel-fusieprocessen.
- Ondersteunt betrouwbare benchmarking van fusieprotocollen over verschillende celtypen heen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij translationele workflows door de generatie van hybride cellen voor preklinische modellering mogelijk te maken.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van celgebaseerde therapieën.
- Vermindert mechanische ambiguïteit in celmanipulatiestrategieën voor therapeutische ontwikkeling.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van therapeutische concepten op basis van cel-fusie.
Pipeline- & workflowintegratie
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door robuuste kwantificering en visualisatie van celfusie mogelijk te maken, wat zowel vroege validatie als translationeel onderzoek ondersteunt.
- Discovery Biology: Kwantitatieve meting van de fusieopbrengst ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking.
- Screening: Duale fluorescentie-read-outs maken reproduceerbare assay-ontwikkeling en benchmarking mogelijk.
- Analytics: Beeldgebaseerde kwantificering biedt objectieve, vergelijkbare outputs voor de beoordeling van condities.
- Translational Research: De generatie van hybride cellen ondersteunt preklinische modellering en biomarker-afstemming.
- Enterprise Reuse: De workflow is aanpasbaar voor verschillende celtypen en onderzoeksprogramma's, wat de waarde van het platform verhoogt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in workflows voor celversmelting.
- Operationele waarde: Standaardiseert de kwantificering van versmelting en ondersteunt de reproduceerbaarheid tussen teams.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie in programma's in een vroeg stadium.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van celgebaseerde therapeutische strategieën mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in celkweek, fluorescentiemicroscopie en beeldanalyse.
- Toegang tot pulsgeneratoren, fluorescentiemicroscopen en software voor beeldverwerking is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van labelings-, beeldvormings- en kwantificeringsprotocollen tussen teams.
- Aanpassing aan verschillende cellijnen kan optimalisatie van de pulsparameters en labelingscondities vereisen.
- De fusie-efficiëntie en levensvatbaarheid zijn afhankelijk van de cellijn en moeten empirisch worden bepaald.
