Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) als een hulpmiddel om gemicroinjecteerd Moleculen en hun Eukaryotische Subcellulaire Doelen Visualiseer

Het algemene doel van het volgende experiment is om fluorescentielabelled kleine moleculen of eiwitten in het cytoplasma van een gekweekte zoogdiercel te introduceren en de geïnduceerde morfologische veranderingen te observeren met een resolutie variërend van micrometers tot meerdere nanometers. Dit wordt bereikt door eerst zoogdiercellen te kweken op gegrideerde glazen dekglasjes en deze vervolgens te micro-injecteren met een fluorescentielabelled klein molecuul of eiwit van belang. Vervolgens worden de cellen gefixeerd in formaldehyde en geobserveerd en afgebeeld met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Vervolgens worden de cellen gefixeerd met glutaraldehyde, in coupes gesneden, gekleurd en afgebeeld met behulp van elektronenmicroscopie. Ten slotte worden de beelden die tijdens veldlichtfluorescentie- en elektronenmicroscopie zijn gemaakt, gecombineerd en uitgelijnd. Uiteindelijk stelt de correlatie van deze beelden de onderzoeker in staat om met een hoge resolutie de perturbaties af te beelden die zijn geïnduceerd door het kleine molecuul of het eiwit van belang.

Hallo, ik ben Dr. Evan Reddick uit het laboratorium van Dr. Neil Alto van de afdeling microbiologie aan het University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas. Vandaag ga ik u vertellen over de M Clem-procedure, oftewel de microinjectie correlatieve licht- en elektronenmicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze procedure ten opzichte van stand-alone technieken zoals microinjectie of microscopie, is dat deze hier in samenhang worden uitgevoerd en worden ondersteund door het gebruik van een gegridde glazen dekglasplaat.

Het is dit gegridde dekglas dat onderzoekers in staat stelt om tijdens verschillende fasen van het protocol terug te keren naar dezelfde cel. Bovendien biedt deze techniek de onderzoeker de mogelijkheid om geïnduceerde subcellulaire architecturale veranderingen waar te nemen door een breed scala aan injecteerbare kleine moleculen of eiwitten van belang, en dit te doen met een resolutie variërend van micrometer tot multi-nanometer. Om de kweekcellen voor te bereiden voor micro-injectie, zoals normale ratenierniercellen of geïmmortaliseerde cervicale kankercellen op foto-geëtste gegridded dekglazen die in live-celkweekschaaltjes zijn bevestigd, worden de cellen geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2.

Pas de confluentie van de cellen aan op basis van de te gebruiken experimentele tijdlijn. Een volledig confluente plaat maakt de identificatie van micro-injecteren cellen in de elektronenmicroscoop zeer moeilijk. Zaai de cellen daarom zodanig dat ze ongeveer 50% confluentie bereiken op de dag van een kort experiment en rond de 25% confluentie voor langere experimenten.

Bereid op de dag van een langer experiment fluorescent gelabelde eiwitten, DNA of kleine moleculen voor in de juiste buffer tot een eindvolume van 50 µL. Voeg, afhankelijk van de gekozen fluorofoor, een tracking-kleurstof toe zoals Texas red of cascade blue. Voeg een concentratie van 0,5 tot 1 mg/mL toe.

Filter de oplossing door een centrifugale filter van 0,22 micron. Nadat de microinjectienaaldjes zijn getrokken volgens de richtlijnen van de fabrikant, worden enkele microliters van de oplossing voorzichtig met een pipet in het uiteinde van een naald gepipetteerd. Plaats de naald in de arm van de micromanipulator van een commercieel microinjectieapparaat dat is bevestigd aan een omgekeerde microscoop.

Plaats een schaal met gecultiveerde cellen in de schaalhouder van de omgekeerde microscoop. Zoek cellen die groeien binnen een gefotOEtste raster en noteer de alfanumerieke identificatie van het raster. Deze zal in alle volgende stappen worden gebruikt.

Het is belangrijk om cellen voor micro-injectie te kiezen die dicht bij het midden van het dekglas kleven en cellen nabij de rand te vermijden. Dit is van belang om een efficiënte overdracht van de geselecteerde cellen naar het centrale deel van de eponhars te garanderen, dat later wordt gebruikt voor elektronenmicroscopie. Laat de injectiearm handmatig over het dekglas zakken en gebruik de micromanipulator om de naald te laten zakken totdat de punt zachtjes het oppervlak van de cellen raakt. Injecteer elke tweede cel binnen het gekozen raster; voor cellen die groeien bij een confluentie van ongeveer 50% worden ongeveer 80 cellen per raster van 600 vierkante micrometer verwacht, wat resulteert in een N van ongeveer 30 tot 40 experimentele en controlecellen.

Plaats na het injecteren de schaal voor de gewenste tijd terug in de incubator om fluorescentiemicroscopie uit te voeren. Verwijder het groeimedium en fixeer de cellen met formaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vervang het fixeermiddel door één XPBS.

Documenteer vervolgens de rangschikking van de cellen door vijf tot 10 brightfield-beelden van het gekozen raster op lage en hoge vergroting te maken. Om de geïnjecteerde cellen te identificeren, worden fluorescentiebeelden gemaakt bij de excitatie- en emissiegolflengten van de inerte injectiekleurstof. Verzamel met behulp van een confocale microscoop een z-stack van beelden van de geïnjecteerde cellen op hoge vergroting binnen hetzelfde eerder gefotografeerde raster.

Hoge vergroting is nodig om fluorescente beelden te correleren met subcellulaire structuren die met behulp van elektronenmicroscopie zullen worden geïdentificeerd. Gebruik na confocale beeldvorming een vloeistof voor het verwijderen van dekglasplaten om het dekglas van de schaal te scheiden en plaats het met de celzijde naar boven in een nieuwe kweekschaal met one XPBS. Ga verder met de verwerking voor elektronenmicroscopie.

Volg vervolgens de standaard EM-protocollen. Om de monsters te fixeren, te kleuren en te dehydreren, bereidt u epon-hars voor en plaatst u het dekglas met de celzijde naar beneden op een buis gevuld met epon-hars. Laat de hars 24 uur polymeriseren bij 60 °C.

Om het dekglas uit de eponhars te verwijderen, wordt het snel ondergedompeld in vloeibare stikstof. De temperatuurschok gaat hierbij van 60 °C naar -196 °C.

Verwijder het dekglas uit de harsbuis. Wacht vijf tot 10 minuten en haal daarna de buis op, die nu vrij is van het dekglas. Inspecteer onder een dissectiescoop het oppervlak van de hars om het gewenste raster te lokaliseren.

Trim het epon-blok met een steriel scheermesje of scalpel zodanig dat alleen het raster van interesse zich op de top van het blok bevindt. Maak met een ultramicrotoom serieknippen van het getrimde blok en gebruik uranylacetaat en loodcitraat om de secties te contrasteren volgens standaardprotocollen. Lokaliseer de gewenste cellen in de elektronenmicroscoop door de relatieve positie van de cellen als leidraad te gebruiken, in combinatie met de eerder gemaakte fluorescentiebeelden met hoge resolutie.

Identificeer in de elektronenmicrografie de gebieden van interesse die overeenkomen met het fluorescentiesignaal. Gebruik referentiepunten, zoals de positie van heterochromatine en de kernenvelope, om te bepalen welk fluorescent Zack-beeld correspondeert met de EM-doorsnede. Open de beelden in een analyseprogramma zoals Image J of Adobe Photoshop, verminder de opaciteit van het fluorescentiebeeld tot 50% en leg dit over het overeenkomstige TEM-beeld heen.

Lijn de beelden uit door de getoonde schaal aan te passen. Hier zijn de resultaten van micro-injectie en correlatieve licht- en elektronenmicroscopie. Deze afbeelding toont de brightfield-micrografie van NRK-cellen die groeien op een lasergeëtst glazen rasterdekglaasje.

Let op de achtergrondletters b en m die worden gebruikt om het raster met de geïnjecteerde cellen te identificeren. De pijlen geven de twee cellen aan die zijn geïdentificeerd en met elektronenmicroscopie zijn afgebeeld. Hier wordt een fluorescentiebeeld getoond van de inerte trackingspoormerkstof cascade blue die wordt gebruikt om micro-geïnjecteerde cellen te identificeren.

Hier is een overlay van de brightfield- en fluorescentiesignalen van een amine-gelabeld klein molecuul. Dit paneel representeert de correlatie van brightfield- fluorescentie- en elektronenmicroscopie van een geïnjecteerde cel. De pijl wijst naar fluorescerende puncta die in dit paneel bij een hogere vergroting zijn afgebeeld.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u een eiwit van belang kunt micro-injecteren en de daaruit voortvloeiende subcellulaire morfologische veranderingen kunt volgen met behulp van de procedure van micro-injectie Clem of correlatieve licht- en elektronenmicroscopie.