Patroon fotostimulering met Digital Micromirror Apparaten voor het Dendritische Integratie Onderzoek Across Branch Punten

Het algemene doel van deze procedure is om complexe lichtpatronen in tijd en ruimte te beheersen, zodat deze kunnen worden gebruikt om neuronen te stimuleren. Dit wordt bereikt door eerst een DMD-chip te positioneren in een geschikt geconjugeerd beeldvlak in het optische pad van de microscoop. De tweede stap van de procedure is om de DMD correct te belichten met een intense lichtbron, zoals een laser.

De derde stap van de procedure is het elimineren van het spikkeleffect van coherente verlichting. De laatste stap van de procedure is het integreren van een grafische gebruikersinterface om de DMD-chip aan te sturen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald waaruit blijkt dat experimenten die voorheen moeilijk uit te voeren waren, nu relatief eenvoudig kunnen worden voltooid via multi-site lysis van gekage neurotransmitters met behulp van het DMD-systeem.

Hoi, ik ben Michael Mohammed uit het laboratorium van Dr. Chaman Tang bij de afdeling Neurologie van de University of Maryland. Vandaag laten we u een procedure zien voor het genereren van complexe eliminatiepatronen in een optische microscoop. We gebruiken deze procedure in ons lab om dendritische integratie te bestuderen.

Laten we beginnen. Dit protocol demonstreert de werking van een digital micro mirror device of DMD-belichtingssysteem voor experimentele neurowetenschappen. Een DMD is een optische halfgeleiderchip met enkele honderdduizenden microscopisch kleine beweegbare spiegels die in een rechthoekig raster op het oppervlak zijn gerangschikt; de positie van elke spiegel komt overeen met de pixel van een afbeelding.

Elke spiegel kan individueel worden aangestuurd om te kantelen tussen twee oriëntaties. In de uit-stand wordt het licht weggeleid van de optische as van de monsterbelichting. In de aan-stand wordt het licht langs de optische as geleid.

DMD is zeer geschikt voor lyse omdat het zeer intens UV-licht talleert, hoge contrastverhoudingen tussen de aan- en uit-pixels genereert en binnen tientallen microseconden tussen deze twee toestanden kan schakelen. De toepassing van DMD's voor biomedisch onderzoek wordt ondersteund door het brede gebruik van software en hardware voor beeldbewerking en door commerciële interesse in het veld van beeldweergave. Modulaire componenten worden door Texas Instruments vermarkt als DLP discovery kits, die de ondersteunende elektronische drivers leveren om de DMD aan te passen aan een microscopisch systeem.

De basisconcepten met betrekking tot de optica van microscopie moeten worden begrepen. De basis van een moderne fluorescentiemicroscoop bestaat uit een beeldpad en een belichtingspad. Deze is samengesteld uit een objectief, een filterkubus en twee afzonderlijke tubuslenzen voor het beeld- en belichtingspad.

De microscoop is zo ontworpen dat deze posities heeft die conjugaat zijn aan het beeldvlak van het preparaat, waarbij objecten die in focus zijn op het preparaatvlak ook in focus verschijnen op deze geconjugeerde beeldvlakken. Een direct gevolg van dit concept is dat elk helder beeld dat op het geconjugeerde beeldvlak wordt gecreëerd, ook scherp geprojecteerd wordt op het beeldvlak van het preparaat. Deze strategie wordt gebruikt om een door de computer gegenereerd verlichtingspatroon op het preparaat te projecteren.

De laserstraal dient als een zeer heldere lichtbron die het patroon verlicht dat door de microspiegels op de DMD-chips in een geconjugeerd beeldvlak is geïmplementeerd. Het ontwerp van een DMD-verlichtingssysteem is afhankelijk van de excitatielichten die worden gebruikt voor optogenetische experimenten, waarbij gebruik wordt gemaakt van licht in het zichtbare golflengtebereik. Het verlichte patroon kan via het camerapad worden geleid.

Daarom kan de DMD-chip eenvoudig worden gemonteerd op een van de twee camerapoorten van een module met dubbele camerapoorten. Omgekeerd moet voor experimenten die licht in het UV-bereik gebruiken, zoals de lyse van caged-verbindingen, het licht via het epi-illuminatiepad worden geleid en moet er een beter toegankelijk geconjugeerd beeldvlak worden gecreëerd. Dit komt doordat de lens van de beeldbuis niet is ontworpen voor UV-transmissie.

In plaats daarvan wordt de objectieflens van de belichtingstube gebruikt voor UV-transmissie, wat een adequaat resultaat geeft bij de beeldvorming. Elke micromirror op de DMD kan schakelen tussen een positieve en een negatieve kanteling van 12 graden ten opzichte van het vlak van de chip. Afhankelijk van de digitale input die van de computer wordt ontvangen, ligt de rotatieas langs de diagonale hoeken van elke mirror, 45 graden ten opzichte van de rechthoekige zijkanten van de chip.

De oriëntatie van de kanteling van de spiegel wordt aangegeven door een goudkleurige driehoek in één hoek op het vooroppervlak van de chip. De kanteling van de microspiegel bepaalt de uitlijning van de pitch en het azimuth van de inkomende verlichtingsstraal. Om de DMD te verlichten, moet eerst de pitch van de verlichtingsstraal worden ingesteld op 24 graden ten opzichte van de loodrechte as van de DMD-chip, en het azimuth loodrecht op de as van spiegelrotatie worden geconfigureerd.

Een nauwkeurige uitlijning van de straal is essentieel voor een efficiënte werking. Voor lyse-experimenten: gebruik een laserbron om de hoogintensieve, focusbare straal te genereren die nodig is voor snelle uncaging.

Hier wordt een quasi-continu, diode-gepompte solid-state frequentie-verdrievoudigde Nd:YAG-laser gebruikt; er is een laser met een relatief hoog vermogen nodig omdat slechts een klein deel van de laseroutput daadwerkelijk op het specimen wordt gericht. Bij het gebruik van een DMD-systeem wordt de output van de laser in een multimodusvezel gekoppeld, zodat deze gemakkelijk kan worden gepositioneerd en georiënteerd langs de juiste as om de DMD te belichten, wat een oplossing biedt voor het spikkelprobleem dat wordt veroorzaakt door coherente verlichting; het licht wordt via de optische vezel getransmiteerd.

De vezel wordt gewonden rond een pazo elektrische vezelstrekker die wordt aangestuurd om deze met een frequentie van ongeveer 40 kilohertz te laten oscilleren. De microscopische rek van de vezel is voldoende om het spikkelpatroon meerdere keren te verschuiven tijdens de milliseconde-duur van elke fotostimulatiepuls, waardoor het spikkelen effectief wordt geëlimineerd. Tot slot wordt de output van de optische vezel via een UV-microscoopobjectief gecollationeerd om de DMD's te belichten, zodat de CCD-pixel geregistreerd kan worden met de DMD-beeldsoftware die individuele DMD-spiegels correleert aan specifieke pixels van de beeldsensor van de CCD-camera.

De grafische gebruikersinterface in de software stelt de gebruiker in staat om met de computermuis de DMD-spiegeloriëntatie toe te wijzen die overeenkomt met het gebied op het CCD-beeld. Markeer de locatie voor fotostimulatie door de cursor over het beeld op het computerscherm te bewegen en klik op het gemarkeerde interessegebied om de opslag van de lichtafgiftepatronen te programmeren. Het patroon dat op het computerscherm als een reeks afzonderlijke beelden is gemarkeerd, programmeert de timing van de laserpulsen voor elk ruimtelijk patroon in de software.

Dit zal worden geïntegreerd met het programma voor data-acquisitie P clamp. Gebruik tot slot het programma voor data-acquisitie om de timing van de DMD-elektronica, de gating van de laser en de acquisitie van het patch-geclampte elektrische signaal van het doelneuron te coördineren. Hier wordt een kalibratie van de resolutie van het optische systeem getoond.

De minimale spotgrootte wordt weergegeven zoals gemeten vanaf een fluorescent doelwit. De effectieve fysiologische resolutie wordt gemeten aan de hand van de amplitude van de stroomvloei als functie van fotostimulatie. Wat betreft de spotpositie werd gecaged glutamaat gefotolyseerd naast een dendritische tak met een diameter van 2 µm.

Terwijl de spot werd verplaatst, zijn de orthogonale elektrische responsen op fotostimulatie van verschillende intensiteiten over de diode geïllustreerd. De voltage-clamp-responsen als functie van de lysis-intensiteit worden getoond.

Gedistribueerde dendritische stimulatie kan eenvoudig worden geïmplementeerd met een op DMD gebaseerd systeem. Hier werd de inputintensiteit gevarieerd door het aantal spots van fotostimulatie, aangegeven als cirkels op de twee dendritische takken, te verhogen. Ruimtelijke sommatie kan non-lineair zijn over vertakkingspunten.

Het wordt steeds meer superlineair bij toenemende inputamplitudes die binnenkomen op de twee vertakkingen bij de splitsing. Deze resultaten illustreren duidelijk de niet-lineaire wijze van sommatie over dendritische vertakkingspunten. De superlineariteit wordt grotendeels gemedieerd door NMDA-receptoren en niet door spanningsafhankelijke kanalen.

Dit kan worden aangetoond door de toepassing van twee NMDA-antagonisten; APV en MK 8 0 1 elimineren het niet-lineaire gedrag grotendeels. We hebben zojuist het basisontwerp en de werking laten zien van een DMD-gebaseerd systeem voor patroonfotostimulatie van neuraal weefsel. Het systeem kan worden aangepast voor stimulatie met zichtbaar licht, zoals gebruikt wordt voor optogenetische experimenten.

Het kan ook worden aangepast voor nabij-UV-licht, zoals gebruikt voor single-photon lysis. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat wanneer er licht met een golflengte van minder dan 400 nanometer wordt gebruikt en de meeste mensen via het epi-illuminatiepad gaan, een nauwkeurige uitlijning van de verlichtingsbundel binnen enkele graden cruciaal is, en dat wanneer er coherent licht wordt gebruikt, spikkeling effectief moet worden geëlimineerd. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.