Opname Meercellige Gedrag in Myxococcus Xanthus Biofilms met Time-lapse Microcinematography

Het algemene doel van het volgende experiment is het ontwikkelen van een goedkope time-lapse microcinematografie-assay met voldoende striktheid om reproduceerbare en kwantificeerbare resultaten te genereren. Dit wordt bereikt door het gebruik van goedkope, herbruikbare siliconen pakkingen voor het construeren van agarmedia-platen of microscoopglasplaatjes. De resultaten tonen aan dat deze plaatcomplexen meer dan een week gehydrateerd en voldoende geoxygeneerd blijven bij verschillende mediatypes en agarkoncentraties.

Daarnaast helpt het gebruik van acht goedkope microscopen om de gegevensverwerving te versnellen, aangezien time-lapse microcinematografie een langzaam proces is. Hallo, ik ben Ryan Taylor van het laboratorium van Dr. Roy Welch van de afdeling Biologie aan de Syracuse University. Vandaag laten we u een procedure zien voor het maken van time-lapse films van bacteriële biofilms; in ons laboratorium gebruiken we deze procedure om het multicellular gedrag van MTI-biofilms te bestuderen.

Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, meet u de celdichtheid van een overnight-cultuur van Occus sanus met een clut-meter. Breng 1 mL van de cultuur over in een centrifugebuis van 2,5 mL. Pelleteer, was en resuspendeer de bacteriën in TPM-medium zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol; pipetteer en vortexeer om het pellet volledig te resuspenderen, wat enige tijd kan duren. Voeg vervolgens 0,5 g aros toe aan 50 mL TPM, wat het assay-medium is.

Voeg daarnaast 0,5 gram aros toe aan 50 milliliters C-T-T-Y-E, wat het voedingsmedium voor de schijfjes is, en steriliseer dit in een autoclaaf. Houd het medium vervolgens op 55 °C in een incubator of waterbad terwijl de tracking-assay wordt opgezet.

De plaatcomplexen worden eerst geconstrueerd op een voedingsschijf; steriliseer het glazen microscoopglas met een vlam. Plaats een steriele silicone rubberen pakking van 0,5 millimeter dik bovenop het objectglas. Pipetteer ongeveer 300 microliters C TT YE-medium in de put die door de pakking op het objectglas is gevormd.

De C-T-T-Y-E medium agro moet met een vlam worden gesteriliseerd; steriliseer vervolgens een andere slide en plaats deze in een hoek bovenop de C-T-T-Y-E medium aros. Het in een hoek plaatsen van de slide voorkomt belvorming. Zodra de slide op zijn plaats zit, wordt het complex vastgezet met kleine binderclips, één aan elke zijde.

Plaats het geknipte complex bij vier graden Celsius en laat het C-T-T-Y-E media agro stollen. Dit duurt gewoonlijk ongeveer vijf minuten. Zodra het agro gestold is, kunnen de plaatcomplexen voor de tracking assay worden voorbereid.

Begin met het voorbereiden van de objectglazen voor het opbouwen van de assaycomplexen. Vlamsteriliseer voor elk complex twee glazen microscoopglaasjes. Plaats een autoclaafpakking bovenop een van de glaasjes om de bodem van de assay te vormen.

Het andere objectglas wordt gebruikt voor het platdrukken van de agros en dient als ondersteuningsglas. De bovenkant van de assay bestaat uit een dekglas. Wikkel eerst een objectglas in labeltape, steriliseer vervolgens een dekglas door middel van vlamsterilisatie en plaats dit bovenop het gewikkelde, gesteriliseerde objectglas.

Schuif de gewikkelde objectglaassteunen omhoog om het dekglas te ondersteunen, zodat het niet barst. Plaats met een pincet een autoclaafpakking boven op het vlamgesteriliseerde dekglas. Druk de pakkingen op het onderste objectglas en het dekglas aan om er zeker van te zijn dat ze een afdichting met het glas vormen.

Anders kunnen de media-arrays uitdrogen. Leg de pakkingen van het objectglas en het dekglas apart met de gesteriliseerde zijden naar boven; werk vanaf nu slechts aan één complex tegelijk om te voorkomen dat de media-arrays stollen, wat zou leiden tot een slechte filmkwaliteit. Begin met het plaatsen van de voedingsschijf.

Haal het nutritieve schijfcomplex uit de koelkast bij vier graden Celsius. Verwijder de bind-eclipse en maak de slides vrij, waarbij de nu gestolde C-T-T-Y-E agar wordt blootgesteld met behulp van een micro-bemonsteringspipet met een wegwerpglazen tip van 100 microliter. Verwijder daarnaast een nutritieve schijf met een diameter van één millimeter uit de C-T-T-Y-E agarmedium en plaats deze in de put die is gevormd door de pakking op het dekglas.

Haal vervolgens de TPM-mediumringen uit de incubator en pipetteer 300 µL in de holte die is gevormd door de pakking op het dekglas en waarin de voedingsschijf zich bevindt. De TPM-mediumringen moeten opbollen om het T-P-M-S-A medium plat te maken. Plaats een van de vlamgesteriliseerde objectglazen zonder pakking onder een hoek bovenop de TPM-mediumringen. Door het objectglas onder een hoek te plaatsen, wordt beluchting voorkomen.

Klem het complex aan beide zijden vast met miniklemmetjes. Plaats het vastgeklemde complex bij 4 °C en laat het medium stollen. Dit duurt gewoonlijk ongeveer vijf minuten.

Zodra het medium is gestold, haalt u het complex uit de koelkast bij 4 °C. Verwijder de klemmen en knijp in het uiteinde van het complex. Om de met tape omwikkelde slide los te maken, verwijdert u deze en plaatst u deze op de werkbank voor verder gebruik.

Gebruik vervolgens een pincet als wig om het complex van het dekglas, de pakking en de media-array van de objectglasdrager te scheiden en gooi de objectglasdrager weg. Gebruik geen hefboomwerking om het complex van het dekglas en de pakking te scheiden, aangezien dit kan leiden tot het breken van het dekglas en/of het vastplakken van de media-array aan de objectglasdrager.

Verwijder het ondersteuningsplaatje en plaats het complex van de dekglasring en de mediummatrix op het met tape omwikkelde objectglas, met de ringzijde naar boven. Plaats dit complex naast een brander zodat al het zichtbare vocht kan verdampen van het nieuw blootgestelde oppervlak van de mediummatrix. Laat de mediummatrix niet langer dan één minuut drogen.

Aangezien dit het zwermgedrag van M Zant zou kunnen beïnvloeden, worden de cellen nu op het nieuw geprepareerde assaycomplex geplaatst. Zodra het overtollige vocht uit de media agros complex van de dekglasafdichting is verdampt, worden 0,5 µL van de geconcentreerde cellen geaspireerd voor depositie op de media. Druk de pipetpunt voorzichtig in voordat u de media agros nadert.

Een druppel cellen verschijnt aan de onderkant van de pipetpunt, waardoor het gemakkelijker is om de cellen te plaatsen zonder dat de punt het agros-medium raakt. Een inkeping in het agros-oppervlak kan het gedrag van de mz-zwerm veranderen. Beweeg de pipet recht naar beneden om de cellen op ongeveer één millimeter afstand van de ingebedde voedingsschijf te dispenseren.

Trek de pipet vervolgens recht omhoog. Op deze manier wordt gewaarborgd dat de zwerm cirkelvormig is. Zodra de cellen zijn gedeponeerd, plaatst u het complex naast de brander om de celspot maximaal 20 seconden te laten drogen.

Lijn na het drogen de pakking van het objectglas, die de onderkant van het complex vormt, uit met de pakking op de afdekplaat. Schuif het gasketmedium acro cell complex, dat de bovenkant van het complex vormt, erin. Druk deze voorzichtig op elkaar om een afdichting te vormen.

Reinig de oppervlakken van het objectglas en het dekglas met een kim wipe om eventuele residuen te verwijderen en condensatie te voorkomen. Plaats het complex direct na het reinigen van de glazen op de verwarmde microscooptafel, met het objectglas naar beneden en het dekglas naar boven. Als er condensatie is ontstaan, laat het glascomplex dan enkele seconden op de verwarmde tafel rusten voordat de software voor beeldacquisitie wordt gestart.

Kies voor de voorbereiding van de opname het juiste objectief op de microscoop, namelijk 2x, 4x of 10x. Schakel de camera en de microscoop in en controleer de lichtintensiteit om er zeker van te zijn dat het licht niet te sterk is. Start de computer op en open het programma voor beeldacquisitie.

Klik op het venster met het live-beeld en stel de microscoop scherp. Het beeld ziet er vergelijkbaar uit met het hier getoonde beeld. Begin met het vastleggen van de beelden.

Controleer tijdens het eerste uur regelmatig de focus, aangezien de media-agar de neiging heeft te bezinken, waardoor de focus kan verschuiven. Zodra de beeldacquisitie is voltooid, worden de verkregen beelden overgezet voor opslag. Ontmantel het objectglascomplex door dit een nacht te weken in 90% ethanol of gebruik TOLA voor de pakkingen om deze opnieuw te kunnen gebruiken.

Deze time-lapse film toont em die zijn onderworpen aan de hier beschreven tracking-assay. De opnamesnelheid is één beeld per minuut bij een vergroting van 20 x; de afspeelsnelheid is 60 beelden per seconde. Deze time-lapse film toont een populatie van eant-cellen waarbij 1% van de cellen GFP tot expressie brengt.

De film is samengesteld door het samenvoegen van afwisselende fasecontrast- en fluorescentiebeelden. De assay werd uitgevoerd op C-T-T-Y-E in 1%Aros; de opnamesnelheid bedroeg één beeld per minuut bij een vergroting van 100 x. Deze time-lapse film toont de glijdende motiliteit van M Anthes.

Deze assay werd uitgevoerd op C-T-T-Y-E in 1%Aros; de opnamesnelheid is één afbeelding per minuut bij een vergroting van 100 x. Deze TimeLapse-film toont de twitching-motiliteit van P OSA. Deze assay werd uitgevoerd op LB in 1%Aros; de opnamesnelheid is één afbeelding per minuut.

Bij een vergroting van 20 x is de afspeelsnelheid 60 beelden per seconde. Deze time-lapse film toont de zwermmotiliteit van Smar senses. Deze assay werd uitgevoerd op LB en 1%Aris; de opnamesnelheid is één beeld per minuut.

Bij een vergroting van 20 x is de afspeelsnelheid 60 beelden per seconde. Deze time-lapse movie toont de glijdende motiliteit van EGT. Deze assay werd uitgevoerd op LB in 0,5% Tag; de opnamesnelheid is één beeld per minuut bij een vergroting van 20 x; de afspeelsnelheid is 120 beelden per seconde vanwege de fragiliteit van 0,5% agarose in lv.

Bij deze assay worden de grotere pakkingen gebruikt, zoals te zien in figuur 1 B. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe time-lapse-video's van bacteriële biofilms kunnen worden gemaakt. Het is bij deze procedure belangrijk om de tijd te nemen en zo nauwkeurig mogelijk te werken om consistente resultaten te verkrijgen.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.