Kwantitatieve analyse van Random migratie van cellen met behulp van time-lapse video Microscopie

Het algemene doel van het volgende experiment is om de migratie van cellen in real-time kwantitatief te meten met behulp van video time-lapse microscopie. Dit wordt bereikt door eerst een zes-well cultuurplaat te coaten met collageen, om vervolgens de gewenste cellen in een lage dichtheid op de gecoate plaat uit te zaaien. In een tweede stap wordt er met een pipetpunt een wond in de plaat gemaakt, zodat er voldoende ruimte is voor migratie.

Vervolgens wordt de microscoop ingesteld en worden er met regelmatige intervallen beelden vastgelegd met behulp van een temperatuurcontrolesysteem om continue monitoring van migrerende cellen in real-time mogelijk te maken. Uiteindelijk wordt het particle tracking-protocol gebruikt om verschillen in de gemiddelde snelheid en de totale verplaatsing van test- en controlecellen te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de avoidant chamber migration assay, is dat deze niet gebaseerd is op kwantitatieve migratiemetingen aan het eindpunt.

In plaats daarvan maakt het de continue monitoring en berekening van verschillende parameters mogelijk. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de cancerbiologie, zoals de vraag hoe specifieke genen of geneesmiddelen de migratie van tumorcellen beïnvloeden. Voeg twee dagen voor de procedure 1,5 milliliters collageen, verdund in opti media, toe aan elke well van een six well culture plate en incubeer de plaat vervolgens één dag voor de procedure gedurende de nacht bij vier graden Celsius.

Resuspendeer de gewenste cellen in twee milliliter DMEM plus FBS per putje en breng de cellen over naar elk putje van de met collageen ENC gecoate plaat, waarbij de cellen een nacht worden geïncubeerd bij 37 graden Celsius. Gebruik op de dag van de procedure een pipetpunt om een wond te maken in de cellen die een nacht zijn gekweekt en was elk putje met PBS om eventueel debris te verwijderen dat als gevolg van de wond is ontstaan.

Voeg DMEM plus FBS toe aan de gespoelde wells en controleer vervolgens onder de microscoop of er een schone wondruimte is gecreëerd. Nadat de microscoopcamera en het apparaat voor live-cell imaging zijn ingeschakeld, wordt de plaat op de microscooptafel geplaatst. Dek de plaat af met de nieuwe environmental control chamber voor live-cell imaging en stel de thermostaat in op 37 °C en de koolstofdioxide op 5%. Open nu de slide book-software in de menubalk.

Selecteer de focusbediening door op de knop met de F in een cirkel te klikken. Gebruik in het objectievenvak het vervolgkeuzemenu om de objectief te definiëren. Selecteer in het filtersetvak de instellingen om de lichtweg naar het I-stuk te leiden. Selecteer het juiste filter voor Bright Field Illumination en klik vervolgens op open Bright.

Open de sluiter voor het helderveld. Selecteer nu het helderveldfilter op de revolver en bekijk het monster via het oculair om de juiste velden te vinden en het monster scherp te stellen. Verplaats vervolgens de filterrevolver om het lichtpad naar de camera te wijzigen. Voor beeldopname in de slide book-software klikt u op focus control en selecteert u XY om verschillende posities via het oculair te kiezen, en klikt u vervolgens op set point om elke locatie vast te leggen.

Stel voor de beeldopname de focus van het camerabeeld op het scherm handmatig nauwkeurig in en gebruik vervolgens de hulpmiddelen in het venster met focusbediening om de Z-positie van de tafel aan te passen. Voor het beste resultaat kunt u focussen op vlakke cellulaire uitstulpingen nabij het contactpunt met de plaat om het scherpstellen te vergemakkelijken. Gebruik de schuifregelaar om de belichtingstijden aan te passen naar een geschikt bereik voor het scherpstellen.

Indien er meerdere XY-posities zijn geselecteerd, pas dan de focus voor elke individuele positie aan door de focusregeling te selecteren. Selecteer vervolgens xy, en daarna visit point. Selecteer in slide book het camera-icoon in de menubalk, selecteer capture type en vervolgens time lapse om de tijdsduur van het experiment in te stellen.

Typ in het vervolgkeuzemenu de gewenste vertraging in tussen het begin van één tijdspunt en het begin van het volgende. In de intervalvelden wordt het derde veld automatisch berekend op basis van de handmatig ingevoerde waarden. Selecteer onder 'multiple XY capture' de optie 'multi-point list' voor experimenten met meer dan één XY-positie.

Geef tot slot het bestand een naam om het op te slaan, ga naar capture control en selecteer advanced, en vervolgens spool. Kies daarna voor capture to memory en save to spool file na elk tijdspunt. Begin door op image te klikken.

Selecteer in de menubalk van het slide book 'import' uit het vervolgkeuzemenu en klik vervolgens op 'slide book spool'. Selecteer de gewenste slide book-bestanden die zijn gegenereerd uit het migratie-experiment voor verschillende velden en tijdstippen. Open het eerste bestand, selecteer vervolgens 'mask' in de menubalk en kies 'particle tracking protocol' uit het vervolgkeuzemenu.

Kies onder het menu voor partikeltracking het protocol voor handmatige partikeltracking. Er verschijnt een venster met start- en eindtijdspunten. Selecteer om willekeurige migratie te analyseren eerst mask en vervolgens het partikeltrackingprotocol. Selecteer vervolgens center of area om de coördinaten voor het centrum van het object te bepalen.

Klik vervolgens op track en ga verder. Kies nu de gewenste statistieken voor elk pad, zoals verplaatsing en gemiddelde snelheid. Klik, zoals hier getoond, op calculate om de statistieken te bekijken.

Een voorbeeld van een analyse van willekeurige migratie, gekwantificeerd in termen van snelheid, wordt in dit kader getoond. In de whiskers-grafiek is in dit experiment een toename van de gemiddelde snelheid waargenomen in M-D-A-M-B 2 31-cellen met een knocked-down tumorsuppressorgen. Vergeleken met de controle M-D-A-M-B 2 31-cellen is hier de willekeurige migratie van de cellen uit de eerste figuur geanalyseerd in termen van celverplaatsing.

Opnieuw vertoonde de groep met volledige knockdown van het tumorsuppressorgen een toegenomen celverplaatsing in vergelijking met de controle M-D-A-M-B 2 31. Cellen in deze time-lapse videomicroscopie-opname van controle MDA MB 2 31-cellen waren gedurende de nacht op collageen gezaaid. De beelden werden vervolgens met intervallen van één uur genomen gedurende een totale periode van 18 uur tijdens random migratie.

Let op hoe de cellen in de loop van de tijd weg bewegen van hun oorspronkelijke posities. In deze film werden de migratie van test M-D-A-M-B 2 31 cellen na een nacht uitzaaiing op collageen geregistreerd en geanalyseerd. Merk op dat de testcellen migratiever zijn in vergelijking met de controlecellen in de vorige film.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals celinvasie en dynas, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de rollen van cellen zijn bij kankermetastase na de ontwikkeling ervan. Deze techniek baande de weg voor onderzoekers in het veld van de celbiologie om celmigratie te bestuderen met behulp van geïsoleerde kankercellijnen.